生物通報道  如同在房地產中一樣，在生物學中位置也很重要�；罨�基因的mRNAs戰略性定位在整個活體組織中，它們的位置往往幫助調控了細胞和組織的生長及發育方式。然而為了同時分析許多的mRNAs，科學學家們不得不將細胞碾磨成漿，這使得他們沒有好的辦法精確確定這些mRNAs在細胞內的定位。

現在，哈佛大學Wyss生物啟發工程研究所和哈佛醫學院的一個研究小組，與Allen腦科學研究所展開協作開發了一種新方法，使得科學家們能夠在完整細胞中同時確定數以千計mRNAs和其他類型RNAs的定位——測定堿基序列來鑒別它們，并揭示出它們在做什么。

研究人員將這種方法命名為熒光原位RNA測序(FISSEQ)，其有可能促成早期癌癥診斷揭示出看似健康組織中驅動癌癥的分子改變。并有可能追蹤癌癥突變以及它們對于現代靶向療法的反應，并揭示出一些更安全、有效的治療靶點。

該方法還有可能幫助生物學家們了解胚胎發育過程中組織的微妙變化——甚至幫助繪制出人類大腦神經元迷宮圖譜。研究人員將這一方法在線發表在《科學》（Science）雜志上。

哈佛醫學院遺傳學教授、Wyss研究所核心成員George Church博士說：“通過全面檢測細胞內的基因表達，我們能夠指出在諸如大腦一類的復雜組織中現在看不到的許多重要差異。這將有助于我們了解組織的形成以及在健康和疾病狀態中的功能機制�！�

鎖定RNAs

在特定的時間健康人類細胞通常會將它們2萬個基因中近半數的基因開啟，它們仔細地選擇這些基因生成所需的細胞反應。此外，細胞還可以上調或下調基因表達，生成少數到數千個基因mRNAs。

但同時精確指出所有這些mRNAs的細胞位置卻是一件難辦的事情。

Church和Wys研究所及哈佛醫學院研究人員Je Hyuk Lee博士迎接了這一挑戰。此外，他們還想同時確定這些RNAs的序列，由此鑒別它們并揭示它們的功能。

Lee和同事們首先采用化學方法處理組織將細胞中數千的RNAs進行固定。隨后，他們利用一些酶將這些RNAs復制成DNA拷貝，然后將這些拷貝進行多次復制，生成一個固定在同一點的復制DNA小球。

他們曾設法同時固定和復制了成千上萬的細胞RNAs。但這些RNAs非常緊密地包裝在細胞內，顯微鏡和照相機都無法將單個復制DNA球的閃光與鄰近的區分開來。

一種RNA成像新方法

為了解決這一問題，研究人員開發了一種非常規方法顯影細胞內的微小物體。它像城市郵政系統一樣運作。如果郵件管理員試圖通過顏色來鑒別她所在城市中的每個家庭，隨著新的家庭建立起來她將很快用完顏色，使得郵件無法投遞。相反，郵件管理員是通過分配給它一個獨特的地址從而追蹤每個家庭。

研究人員意識到他們可以給細胞內的每個RNA分配一個獨特的地址：RNA自身分子中的堿基序列。他們認為采用類似新一代DNA測序的方法他們可以讀取這一地址。

在新一代測序中，科學家們碾磨組織，提取其DNA，讓DNA斷裂成小片段，然后稀釋這些片段使得每個DNA片段都能附著到載玻片單個位點上。他們利用一些酶和4種不同的熒光染料——每種染料代表一種堿基——使得DNA閃現一連串顏色，揭示它的序列。

采用類似的方法，科學家們嘗試在細胞中固定RNA,生成包含許多復制DNA的小球，然后采用新一代DNA測序，因此它能夠在固定細胞中起作用。4種閃光顏色可揭示每種復制DNA的堿基序列，告訴他們匹配RNA的堿基序列。這些序列理論上可提供無限數量的獨特地址——一個原始RNA一個地址。

起初科學家們難以顯影整個組織景觀仍在視野范圍內時遠距離單個復制DNA球的閃光。他們通過在特定時間選擇性開啟部分閃光點取得了成功，因此可以區分整個細胞區域的單個復制DNA閃光球。

這一策略只在他們能夠讀取到足夠多的堿基序列提供一個獨特的地址時才會起作用。最初，他們能夠確定的復制DNA堿基不超過6個，不能提供足夠多獨特的地址鑒別人類基因組中的單個基因。這時哈佛醫學院的研究生Evan Daugharthy加入進來。

Fisseq起作用

Daugharthy首先設計了一種算法利用人類基因組中已知的基因序列來定位復制DNA序列。將不能對應真正基因的閃光從圖像中刪除。

隨后Daugharthy利用了一種商業化DNA測序試劑盒，這使得研究小組能夠測序30個堿基，足夠給每種復制DNA提供一個獨特的地址。以這種方式，研究小組生成了對應人類基因組中每個基因的RNA序列和位置的合成圖像。

Lee、 Daugharthy和同事們隨后對這種方法進行測試，檢測了當皮膚細胞在培養皿中增殖、遷移并愈合模擬傷口時開啟的基因。相比于邊緣線上靜坐的鄰近細胞，生長到創傷處的細胞有12種基因表達改變。相似的試驗可以確定病變組織的一些新標記物或靶向分子治療的一些新靶點。

Wyss研究所主任Don Ingber,說：“George研究小組完成了一個技術杰作。通過難以置信地確定微妙但極其重要的基因表達改變，精確確定它們的細胞內定位，他們幫助打開了細胞診斷學新時代的大門�！�

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ

Understanding the spatial organization of gene expression with single-nucleotide resolution requires localizing the sequences of expressed RNA transcripts within a cell in situ. Here, we describe fluorescent in situ RNA sequencing (FISSEQ), in which stably cross-linked cDNA amplicons are sequenced within a biological sample. Using 30-base reads from 8742 genes in situ, we examined RNA expression and localization in human primary fibroblasts with a simulated wound-healing assay. FISSEQ is compatible with tissue sections and whole-mount embryos and reduces the limitations of optical resolution and noisy signals on single-molecule detection. Our platform enables massively parallel detection of genetic elements, including gene transcripts and molecular barcodes, and can be used to investigate cellular phenotype, gene regulation, and environment in situ.