生物通報道：自從哈佛大學(xué)遺傳學(xué)家George Church和454 Life Sciences公司Jonathan Rothberg掀起二代測序NGS的革命以來，已經(jīng)過去了將近十年。毫不夸張地說，這段時間以來NGS技術(shù)已經(jīng)發(fā)生了翻天覆地的變化，在測序通量突飛猛進的同時，測序成本直線下降。

二代測序領(lǐng)域的2013年既忙碌又喧囂，在開年之際讓我們對這一領(lǐng)域發(fā)生的最新進展做個小結(jié)吧。

Pacific Biosciences

Pacific Biosciences公司以長讀取的二代測序技術(shù)著稱。據(jù)該公司的創(chuàng)始人Steve Turner介紹，在新測序化學(xué)P5-C3的幫助下，如今PacificBio的測序讀長已經(jīng)達到了8.5kb。P5-C3“提供了一個保護性的支架”，可以阻止酶和熒光團之間發(fā)生身體接觸，避免酶受到潛在的光學(xué)損傷。

“我們已經(jīng)很大程度上減少了系統(tǒng)中的光學(xué)損傷，我們相信現(xiàn)在測序讀長受到的限制，只來自于樣品本身，”Turner說。 樣品本身的限制是指，讀長越長就越難生成不含損傷位點或缺口的測序模板，而這樣的缺口會導(dǎo)致測序過早中止。

目前PacBio® RS II和SMRT Cell系統(tǒng)，每次運行可產(chǎn)出50,000個讀取（約400 million bp）。這一數(shù)字會在接下來的一年中繼續(xù)增漲，Turner說。“我們預(yù)計在2014年內(nèi)，令測序讀長再增加50%，并于2015年達到20,000bp。”

最近研究人員發(fā)表文章向人們展示，在新裝配方法HGAP的幫助下（hierarchical genome-assembly process），可以實現(xiàn)只利用PacBio化學(xué)法對真核基因組進行從頭裝配。一月份，該公司公布了對黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）進行的完整二倍體基因組裝配，生成了長達24.6 Mb的重疊群（contigs），N50值為15.2 Mb（N50值反映了重疊群的長度）。就在上周，PacBio公司又公布了一個54x覆蓋度的單倍體人類基因組裝配，生成了“3.25 Gb的基因組裝配，重疊群N50值為4.38 Mb，其中最長的重疊群達到44 Mb。”

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Oxford Nanopore

Oxford Nanopore公司無疑是納米孔測序的領(lǐng)導(dǎo)者，這一技術(shù)也被稱為第三代測序。該公司去年十月份宣布，將在2014年年初推出USB大小的MinION™測序儀，為客戶提供先期體驗（early-access）。

與其他類似先期體驗項目不同的是，Oxford Nanopore公司不會局限于傳統(tǒng)的測序中心，而是向廣大的個人用戶敞開大門。該公司準(zhǔn)備在接下來的一周發(fā)出邀請。

Oxford Nanopore公司強調(diào)，不是每個MinION Access Program（MAP）申請者都會在第一輪受到邀請，而且公司提供的MinION數(shù)量也可能少于申請者的要求。這些儀器將在六周內(nèi)進行發(fā)送。

2012年，Oxford Nanopore公司在AGBT上描述了兩個測序系統(tǒng)，MinION就是其中之一，另一個產(chǎn)品是GridION™。據(jù)公司發(fā)言人稱，MinION的大小使其更容易受到人們的關(guān)注，它的靈活性和測序能力將推動NGS進一步邁向普羅大眾。

Oxford Nanopore公司希望通過MinION Access Program評估測序系統(tǒng)的實用性、對不同應(yīng)用的適應(yīng)性、數(shù)據(jù)分析、以及公司的物流運輸和試劑分配等。這些數(shù)據(jù)將有助于未來開展的GridION先期體驗項目，不過該公司還未公布這一項目的具體啟動時間。

廣泛的應(yīng)用前景

在二代測序技術(shù)不斷進步的同時，它的應(yīng)用也越來越廣泛。據(jù)Mardis介紹，二代測序在臨床領(lǐng)域的應(yīng)用快速增漲。越來越多的研究者選擇二代測序的多基因panel對腫瘤進行研究，或者通過外顯子測序鑒定潛在的藥物靶點。在診斷兒童遺傳學(xué)疾病時，人們也逐漸拋開了傳統(tǒng)的診斷方法，轉(zhuǎn)而使用全外顯子組測序。

Mardis補充到，NGS檢測有兩大優(yōu)勢，它既可以幫助人們確定治療方案，也可以為患兒父母評估他們未來子女患同樣疾病的風(fēng)險。實際上Church認為，用二代測序進行（致病基因）攜帶者篩查，是NGS的“殺手锏”。

“任何考慮使用輔助生殖手段的人…都應(yīng)當(dāng)知道精子捐獻者是否攜帶與嚴(yán)重疾病有關(guān)的隱性等位基因，”他說。“人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個能夠預(yù)測疾病的基因，現(xiàn)在也有不少服務(wù)可以對它們進行準(zhǔn)確的檢測。”

最近，Church作為共同作者發(fā)表了一項新研究。據(jù)他介紹，這是首次發(fā)表用NGS進行攜帶者篩查的文章，他們的方法“充分提高了質(zhì)量并且降低了成本”。研究團隊使用padlock探針，在194個細胞系中抽出并測序了15個有臨床意義的基因，其中55個細胞系來自于攜帶上述基因突變的個體。

二代測序的另一個新興的應(yīng)用領(lǐng)域是單細胞RNA測序。“單細胞RNA測序能向我們展示，相同細胞中RNA表達的天然隨機性，這一點非常吸引人。” Mardis說。

Church介紹到，他即將發(fā)表的一篇文章描述了一種新的測序方案，稱為熒光原位測序（fluorescent in situ sequencing）。這一技術(shù)將熒光原位雜交和RNA-Seq結(jié)合起來，能夠計數(shù)并確定不同轉(zhuǎn)錄本在組織切片中的空間定位。

Church的團隊通過熒光原位測序證實，轉(zhuǎn)錄本會依據(jù)傷口的愈合情況在成纖維細胞中呈不對稱分布。（Science禁止透露進一步的細節(jié)）

這樣的數(shù)據(jù)在十年前簡直難以想象。同樣，我們也很難想象NGS在未來十年又會發(fā)生怎樣的翻天覆地的變化。

上接：二代測序，新年新總結(jié)（上） 

參考文獻：

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[3] Umbarger, MA, et al., “Next-generation carrier screening,” Genet Med, published online June 13, 2013. [PubMed ID: 23765052]