生物通報(bào)道：重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)（由英國公司TwistDx Inc開發(fā)）。以此為基礎(chǔ)的TwistAmp® 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA擴(kuò)增的基礎(chǔ)體系（TwistAmp® Basic）含有DNA擴(kuò)增所需的所有試劑，我們只要準(zhǔn)備好引物和模板就行。在這個(gè)基礎(chǔ)體系中添入不同的酶和探針，可以實(shí)現(xiàn)多樣化的RPA應(yīng)用，比如RNA擴(kuò)增檢測和實(shí)時(shí)RPA檢測等等。

RPA反應(yīng)需要用多少引物？

RPA基礎(chǔ)反應(yīng)每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有時(shí)，稍微改動(dòng)一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進(jìn)行測試（從200nM 到600nM）將有助于找到最合適的引物濃度。

RPA反應(yīng)需要用多少探針？

RPA反應(yīng)一般每次需要120nM探針。不過，略微改變探針的濃度有時(shí)會(huì)促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。我們可以在一定濃度范圍內(nèi)（從50nM到150nM），根據(jù)自己的具體應(yīng)用對探針進(jìn)行優(yōu)化。

現(xiàn)成的PCR引物能用于RPA么？

多半不行。絕大多數(shù)PCR引物不能用于RPA，因?yàn)樗鼈兲�短了重組效率低。

現(xiàn)成的PCR探針能用于RPA么？

不能。絕大多數(shù)常用的PCR探針并不適合RPA反應(yīng)。特別是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探針系統(tǒng)，這樣的酶活性與RPA根本不兼容。

怎樣才算是好引物？我應(yīng)該怎樣設(shè)計(jì)RPA引物？

RPA引物還沒有一個(gè)嚴(yán)格的設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，所以需要進(jìn)行篩選。（引物設(shè)計(jì)具體參見：PCR替代技術(shù)，RPA全攻略之引物設(shè)計(jì)）

RPA引物需要多長？

RPA引物一般在32至35個(gè)核苷酸之間。某些情況可能用到少于30個(gè)核苷酸的引物，但擴(kuò)增過程會(huì)顯著減緩。

RPA引物應(yīng)當(dāng)相距多遠(yuǎn)？

這取決于你的具體應(yīng)用。標(biāo)準(zhǔn)TwistAmp®試劑盒適用于不超過500bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的大小是沒有下限的，不過RPA引物一般需要擴(kuò)增子超過80bp。擴(kuò)增產(chǎn)物在100-200bp之間，可以實(shí)現(xiàn)最快的RPA擴(kuò)增。

在特定條件下，RPA擴(kuò)增產(chǎn)物能夠達(dá)到2kb。不過，目前的TwistAmp®試劑盒無法生成這么大的片段。

我需要篩選多少引物？

這取決于你對檢測靈敏度的要求。舉例來說，如果目標(biāo)分子上千，那么絕大多數(shù)引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話，最好是進(jìn)行系統(tǒng)性的引物篩選。一開始篩選的時(shí)候，候選引物可以有10到20對。測試的引物越多，找到好引物的幾率也就越大。

篩選引物的時(shí)候必須用探針么？

不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對于篩選高靈敏度引物來說，用檢測探針對擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控被證明是最快也最省力的方法。

引物篩選時(shí)應(yīng)該用什么樣的條件？

引物篩選的條件最好盡量模擬實(shí)際檢測時(shí)的條件，例如模板的拷貝數(shù)、樣本純度等等。

給定引物的性能還能再提高么？

一般來說，稍微改動(dòng)一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進(jìn)行優(yōu)化：以單核苷酸為基礎(chǔ)略微改變引物的長度；或者保持引物長度不變，以1bp為基礎(chǔ)移動(dòng)引物的位置。經(jīng)過了改動(dòng)的引物，需要重新進(jìn)行擴(kuò)增活性的測試。

RPA引物的熔解溫度應(yīng)該是多少？

RPA反應(yīng)是在常溫下進(jìn)行的，DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統(tǒng)估算的熔點(diǎn)不適用于這個(gè)系統(tǒng)。

RPA引物需要特別純化么？

在進(jìn)行引物篩選的時(shí)候，一般不需要純化。在其他情況下，引物的質(zhì)量會(huì)造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴(yán)格，最好先純化引物再進(jìn)行RPA反應(yīng)。

經(jīng)過一種TwistAmp®試劑盒測試的引物，能直接用于其它TwistAmp®試劑盒么？

不一定。舉例來說，經(jīng)TwistAmp®基礎(chǔ)試劑盒測試的引物，不能直接用于exo或nfo試劑盒，因?yàn)?/SPAN>exo和nfo還要把探針納入考慮。另外，跑膠檢測、熒光檢測或側(cè)流層析檢測對引物有不同的要求，不能一概而論。DNA檢測和RNA檢測也一般不能共用引物，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄酶和聚合酶有著不同的偏好。

我要怎么選擇探針？

TwistAmp官網(wǎng)上提供有不同檢測探針的設(shè)計(jì)指南。需要注意的是，TwistAmp® exo探針有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探針設(shè)計(jì)更為靈活，但它生成的熒光信號沒有TwistAmp® exo探針強(qiáng)。

使用引物和探針的時(shí)候還需要注意些什么？

引物和探針需要同時(shí)添加到體系中，一先一后會(huì)使片段重組出現(xiàn)偏向性。

生物通編輯：葉予