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PCR替代技術,RPA引物與探針的常見問題
【字體: 大 中 小 】 時間:2014年11月05日 來源:生物通
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RPA擴增的基礎體系(TwistAmp® Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑,我們只要準備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針,可以實現多樣化的RPA應用,比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
生物通報道:重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(由英國公司TwistDx Inc開發)。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品,能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低,特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。
RPA擴增的基礎體系(TwistAmp® Basic)含有DNA擴增所需的所有試劑,我們只要準備好引物和模板就行。在這個基礎體系中添入不同的酶和探針,可以實現多樣化的RPA應用,比如RNA擴增檢測和實時RPA檢測等等。
RPA反應需要用多少引物?
RPA基礎反應每次需要480nM引物,TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有時,稍微改動一下引物的用量可以提高其性能。對不同引物濃度進行測試(從200nM 到600nM)將有助于找到最合適的引物濃度。
RPA反應需要用多少探針?
RPA反應一般每次需要120nM探針。不過,略微改變探針的濃度有時會促進反應的進行。我們可以在一定濃度范圍內(從50nM到150nM),根據自己的具體應用對探針進行優化。
現成的PCR引物能用于RPA么?
多半不行。絕大多數PCR引物不能用于RPA,因為它們太短了重組效率低。
現成的PCR探針能用于RPA么?
不能。絕大多數常用的PCR探針并不適合RPA反應。特別是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探針系統,這樣的酶活性與RPA根本不兼容。
怎樣才算是好引物?我應該怎樣設計RPA引物?
RPA引物還沒有一個嚴格的設計標準,所以需要進行篩選。(引物設計具體參見:PCR替代技術,RPA全攻略之引物設計)
RPA引物需要多長?
RPA引物一般在32至35個核苷酸之間。某些情況可能用到少于30個核苷酸的引物,但擴增過程會顯著減緩。
RPA引物應當相距多遠?
這取決于你的具體應用。標準TwistAmp®試劑盒適用于不超過500bp的擴增產物。RPA擴增產物的大小是沒有下限的,不過RPA引物一般需要擴增子超過80bp。擴增產物在100-200bp之間,可以實現最快的RPA擴增。
在特定條件下,RPA擴增產物能夠達到2kb。不過,目前的TwistAmp®試劑盒無法生成這么大的片段。
我需要篩選多少引物?
這取決于你對檢測靈敏度的要求。舉例來說,如果目標分子上千,那么絕大多數引物都夠用了。對靈敏度要求很高的話,最好是進行系統性的引物篩選。一開始篩選的時候,候選引物可以有10到20對。測試的引物越多,找到好引物的幾率也就越大。
篩選引物的時候必須用探針么?
不一定。任何檢測方法都可以用來評估候選引物的性能。不過對于篩選高靈敏度引物來說,用檢測探針對擴增進行實時監控被證明是最快也最省力的方法。
引物篩選時應該用什么樣的條件?
引物篩選的條件最好盡量模擬實際檢測時的條件,例如模板的拷貝數、樣本純度等等。
給定引物的性能還能再提高么?
一般來說,稍微改動一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何給定的引物都可以通過以下方法進行優化:以單核苷酸為基礎略微改變引物的長度;或者保持引物長度不變,以1bp為基礎移動引物的位置。經過了改動的引物,需要重新進行擴增活性的測試。
RPA引物的熔解溫度應該是多少?
RPA反應是在常溫下進行的,DNA的解鏈與PCR有很大不同。傳統估算的熔點不適用于這個系統。
RPA引物需要特別純化么?
在進行引物篩選的時候,一般不需要純化。在其他情況下,引物的質量會造成批次間的差異。如果對一致性要求比較嚴格,最好先純化引物再進行RPA反應。
經過一種TwistAmp®試劑盒測試的引物,能直接用于其它TwistAmp®試劑盒么?
不一定。舉例來說,經TwistAmp®基礎試劑盒測試的引物,不能直接用于exo或nfo試劑盒,因為exo和nfo還要把探針納入考慮。另外,跑膠檢測、熒光檢測或側流層析檢測對引物有不同的要求,不能一概而論。DNA檢測和RNA檢測也一般不能共用引物,因為逆轉錄酶和聚合酶有著不同的偏好。
我要怎么選擇探針?
TwistAmp官網上提供有不同檢測探針的設計指南。需要注意的是,TwistAmp® exo探針有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探針設計更為靈活,但它生成的熒光信號沒有TwistAmp® exo探針強。
使用引物和探針的時候還需要注意些什么?
引物和探針需要同時添加到體系中,一先一后會使片段重組出現偏向性。
生物通編輯:葉予