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        RPA技術試水二代測序的文庫制備

        【字體: 時間:2014年11月03日 來源:生物通

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          為此,Wellcome Trust Sanger 研究所的研究團隊對測序文庫的制備進行了優化,找到了既適合低量樣本又耐受高AT含量的文庫制備方案。這項研究發表在2012年的BMC Genomics雜志上。

        生物通報道:重組酶聚合酶擴增RPA被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA擴增的速度非常快,靈敏度高,對硬件設備要求低,而且不需要復雜的樣本處理。這樣的技術特別適合于體外診斷、獸醫、食品安全、生物防御、農業等領域。

        大規模并行測序技術(即二代測序NGS)是基因組和遺傳學領域的一次技術革命。NGS自誕生以來,不論是測序規模還是測序效率都有了飛速的提升。盡管這一技術已經取得了巨大的成功,但有著極端堿基組成的基因組區域,對于目前的NGS平臺來說仍然是一個很大的挑戰。

        不少重要的病原體都具有極端的堿基組成,比如瘧原蟲(高AT含量)和結核桿菌(高GC含量)。PCR擴增是標準的文庫制備程序,不過PCR會導致不均勻的讀取覆蓋度(特別是在富含ATGC的區域),最終影響基因組的裝配和變異分析。而省卻PCR擴增的文庫制備方案,需要大量的初始材料,不適合處理從臨床上分離的樣本。

        為此,Wellcome Trust Sanger 研究所的研究團隊對測序文庫的制備進行了優化,找到了既適合低量樣本又耐受高AT含量的文庫制備方案。這項研究發表在2012年的BMC Genomics雜志上。

        研究人員用非臨床和臨床分離物(含大約53%的宿主污染物)制備Illumina測序文庫,分別使用了不同的聚合酶、PCRRPA方法,并對測序結果進行了分析和比較。他們在此基礎上增強了高AT含量區域的測序覆蓋度,減少了極端堿基組成帶來的偏向性。

        這項研究的RPA等溫擴增直接使用了TwistAmp基礎反應,沒有進行任何優化。結果顯示,RPA制備測序文庫時產量相對較高,與標準Illumina文庫制備相比,對極端堿基組成的模板偏向性較少,覆蓋度有一定的提升。不過測序后的嵌合和重復讀取(chimeric and duplicate reads)相對較多。(延伸閱讀:核酸檢測的一場革命,可替代PCR的犀利技術

        這次嘗試說明,未來經過優化的RPA技術將有望用于二代測序的樣本制備。(參考文獻:Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.

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