生物通報道  Cas9是一種可通過一條RNA鏈進行重編程，靶向特異DNA序列進行精確切割、粘貼，開啟或關閉基因的蛋白質“機器”。自從Cas9被發現以來，研究人員一直利用它來作為一把有潛力的鑰匙開啟遺傳疾病新療法。但這一切只有在完全了解它的運作機制的條件下才能實現

這就是David R. Liu和他的學生Vikram Pattanayak以及John Guilinger在從事的工作。

David R. Liu現為哈佛大學化學及化學生物學教授，霍華德休斯醫學研究所研究員。據稱這位教授是一位從來沒有做過博士后的年輕教授，他早年畢業于哈佛大學，1999年在加州大學伯克利校區攻讀博士學位，在Peter Schultz教授指導下從事核糖核酸研究，并自主首次開始活細胞遺傳密碼的研究。之后就被哈佛大學任命為助教授，2004年晉升為教授。Liu教授曾被麻省理工學院技術評論列入全球Top 100 青年發明家（35歲以下），“大眾科學”亦將其列入全美Top10最具才氣的青年科學家。

David R. Liu聯合加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna教授，率先對Cas9進行了一次詳細的特異性分析，揭示了Cas9能夠導向其編程靶向的DNA序列的精確度，以及這一蛋白質/RNA復合物對于誘餌脫靶序列的敏感度。這項工作描述在近期的《自然生物技術》（Nature Biotechnology）雜志上。

David R. Liu說：“一個重要的問題決定了像Cas9這樣的技術多大程度上可以成為有用的研究工具，尤其是用于人類治療：就是它們的特異性。”

“眾所周知，有能力操控我們的基因組結構有可能會對人類的健康產生深遠的影響。但在你施予患者某些將改變他們基因的治療之前，你需要非常地確定它將不會在別處造成意料之外的效應，因為切割一個靶位點以及脫靶位點有可能意味著導致治療疾病或是觸發癌癥形成兩種不同的結局。”

盡管Cas9有望操控人類基因組，但這一系統是以細菌的免疫系統為基礎生成。

不同于人類免疫系統生成抗體來對抗疾病，細菌是將一小部分病原體DNA插入到它們自身的基因組中。利用這一外源DNA片斷來重編程Cas9機器，細菌可以擊退病原體的感染。

在實驗室中利用Cas9始于研究人員發現了一個獨特的興趣位點，其長度大約是20-23個堿基對。研究人員隨后設計出了一條只匹配這一靶DNA片段的“引導”RNA單鏈。當Cas9機器和這條引導RNA在靶DNA位點上遭遇時，Cas9會執行它的功能。Cas9可自然切割DNA，研究人員已經設計出了一些Cas9變異體來開啟或關閉靶基因的表達。

David R. Liu說，問題在于盡管理論上Cas9/RNA復合物僅結合到基因組的特異位點，但卻從來沒有對其精確度進行過充分的研究。

“我們可以設計出極好地匹配一個特異性DNA位點的RNA，但基因組非常的巨大。在基因組的別處有可能存在非常相似的序列。問題是，如果在基因組中有另一個位點與靶序列的差異僅為1個堿基，2個堿基，或是4個堿基時，Cas9會切割這些脫靶位點嗎？”

研究人員還解答了一些其他的問題，包括是否容許靶DNA各個位點發生多處錯配，這一20個堿基對序列的錯配是否或多或少與它們橫跨引導RNA的位置有關系？引導RNA的結構有可能如何影響這一系統的準確性？

他們發現盡管整個RNA序列對于將Cas9傳送至正確的位點起重要的作用，對于錯誤的容忍度可隨靶向的基因組位點，以及錯配發生在引導RNA序列的位置而發生改變。

更重要的是，研究人員發現提高Cas9的濃度以及改變引導RNA的結構，都可以提高Cas9的活性，導致準確性降低。

David R. Liu說：“一個重要的信息就是要在活性和特異性之間進行權衡。這是一個重要的教訓，因為當科學家們開發這些工具成為有希望的治療時，他們需要確保在提高活性時，不會導入新的脫靶切割效應。”

為了避免這些問題，David R. Liu和其他的研究人員正致力于設計能夠比自然進化的這一系統更為精確的Cas9版本。

（生物通：何嬙）

生物通推薦原文摘要：

High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity

The RNA-programmable Cas9 endonuclease cleaves double-stranded DNA at sites complementary to a 20-base-pair guide RNA. The Cas9 system has been used to modify genomes in multiple cells and organisms, demonstrating its potential as a facile genome-engineering tool. We used in vitro selection and high-throughput sequencing to determine the propensity of eight guide-RNA:Cas9 complexes to cleave each of 1012 potential off-target DNA sequences. The selection results predicted five off-target sites in the human genome that were confirmed to undergo genome cleavage in HEK293T cells upon expression of one of two guide-RNA:Cas9 complexes. In contrast to previous models, our results show that guide-RNA:Cas9 specificity extends past a 7- to 12-base-pair seed sequence. Our results also suggest a tradeoff between activity and specificity both in vitro and in cells as a shorter, less-active guide RNA is more specific than a longer, more-active guide RNA. High concentrations of guide-RNA:Cas9 complexes can cleave off-target sites containing mutations near or within the PAM that are not cleaved when enzyme concentrations are limiting.