單細胞轉錄組學和蛋白質組學

NanoString Technologies的科學家發現，細胞群體的RNA平均表達水平不一定與群體中單個細胞的RNA表達相同。例如，有些基因持續在低水平表達，而另一些則在短時間內大量表達。對宏觀測定而言，這樣的表達模式被平均化。

該公司獨特的數字表達譜分析系統能直接對單個RNA分析進行計數，最多可分析單細胞中的800個不同分子。這是利用nCounter Single Cell Gene Expression Assay中的分子條形碼來實現的，它識別特定的RNA分子。單細胞樣品在裂解后，經過逆轉錄和預擴增，隨后與分子條形碼雜交，純化后在nCounter®分析儀上讀取。

哈佛大學的Hongkun Park研究小組與Broad研究院的Aviv Regev研究小組合作，來研究看似均質細胞中的基因表達異質性¹。Park、Regev及其同事利用一種稱為Smart-Seq的技術，來讀取RNA轉錄本的覆蓋。與原先的RNA-Seq方法相比，Smart-Seq讓研究人員能夠更詳細了解mRNA選擇性剪接所產生的異構體，同時更好地鑒定單核苷酸多態性（SNP）。

通過計算機分析，Regev和Park發現，mRNA豐度和剪接模式都存在之前未觀察到的雙峰（bimodal）變化，并通過RNA-熒光原位雜交（FISH）對精選轉錄本進行了驗證。如今，他們正在擴展樣品類型。Park談道：“目前我們正將單細胞RNA-Seq方法應用在各種免疫細胞、神經細胞和癌癥細胞上，以便了解驅動細胞之間變化的因素、這種變化的動力學及其生物學影響。”

Regev和Park的團隊也在探索另一種新技術，最初由斯坦福大學Garry Nolan實驗室開發的CyTOF Mass Cytometry。這種方法結合了質譜和流式細胞術，讓研究人員能夠分析單細胞所表達的幾十種不同的mRNA或蛋白質。CyTOF由DVS Sciences公司推出，曾被The Scientists雜志評為2011年十大創新技術之一。

RNA測序領域的另一項進展是RNA-capture-seq，在測序之前用Tiling芯片來放大轉錄組的一部分。這樣能帶來更好的分辨率，并且只關注感興趣的區域。安捷倫科技公司提供這種目標捕獲的工具，Illumina和羅氏NimbleGen也有。

安捷倫的高級產品經理Anniek De Witte認為，目標富集策略，如RNA-capture-seq，特別適合臨床研究應用，其中細胞極其稀少，如循環腫瘤細胞，或胚胎活檢的單細胞。研究人員也會對異質的腫瘤樣本感興趣，因為每次研究一個細胞非常重要。

高內涵成像

隨著成像系統的分辨率以及試劑的不斷改善，顯微鏡專家也開始將他們的注意力轉移到單個細胞。賽默飛世爾科技為單細胞和細胞群體的高內涵成像和分析提供了工具。他們的儀器有Thermo Scientific™ ArrayScan™和CellInsight™高內涵成像儀；他們也為高內涵成像時的多重分析提供試劑和抗體。

高內涵，意味著從單個細胞中提取大量信息。因此，賽默飛世爾的儀器都配備了靈敏的檢測器，尤其適合那些昏暗的樣品，或者活細胞樣品，為了減少光毒性作用而不得不采用弱光。其中一個例子就是ArrayScan Infinity高內涵平臺，它的共聚焦模塊特有增強分辨率的功能，如高速Nipkow轉盤技術和可變針孔（pin-hole），可精確控制目標內的圖像獲取。

高內涵分析過去主要在制藥研究中開展，而如今也漸漸普及到科研機構。通用電氣醫療集團生命科學部細胞技術方面的首席科學家Nick Thomas也看到了科研和制藥機構之間的需求轉變。該公司的高內涵篩選儀器IN Cell Analyzer過去主要用在制藥公司，但在最近幾年，客戶基礎發生了一些改變。據介紹，相當一部分的儀器及組件是出售給了科研機構。

隨著這種轉變，通用電氣也在積極響應，不斷開發新的試劑和軟件。他們的研發小組曾改造了帶GFP融合蛋白的細胞，以作為探針。據Thomas介紹，這些GFP探針相當靈敏，可用于查看細胞的細節，如細胞周期的變化。“這些工具的開發補充了儀器的力量，”他補充道。

研發小組的另一個方向是讓藥物開發人員和科研人員能夠了解單個細胞隨時間的變化。許多藥物作用于線粒體，這對于心臟細胞或肝細胞而言可能損害較大。這兩個器官都有著很高的能量要求，需要帶許多線粒體的細胞。Thomas認為，線粒體是高內涵成像的一個理想目標，讓研究人員能夠在較大的藥物濃度范圍或較長的治療時間內觀察線粒體的形態或完整性。

GE有兩種IN Cell型號。一個帶有CCD照相機及500萬像素的成像芯片。它讓用戶能夠在低倍物鏡下觀察廣泛的區域，從而讓每幅圖像中的細胞數量最大化。Thomas表示：“由于用的是高像素照相機，您仍有足夠的分辨率來進行圖像分析。”另一個型號則用的是CMOS照相機。再結合以激光為光源的可變光闌線掃描，滿足了共聚焦成像的需求。此外，實驗中每個熒光通道的成像從寬場到共聚焦范圍內連續可調，讓用戶可以充分控制成像速度和圖像質量。

Thomas認為，這樣的安排能夠讓研究人員更高效地開展實驗。舉個例子，一位研究人員正在開展四色分析，僅僅一個通道需要共聚焦，以便詳細觀察線粒體。那么，共聚焦可限制在紅色通道，而藍色、綠色和橙色通道關閉。這樣，他就能節省大量的時間。有了這臺儀器，用戶只在需要的時候共聚焦，而不會讓成像速度受到影響。Thomas相信這一靈活的功能讓IN Cell Analyzer 6000與眾不同。

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真的從一個細胞中獲得DNA和RNA數據？這雖然有難度，但隨著各種技術的不斷發展，相信這一夢想將會很快實現。（生物通 余亮）

參考文獻

1. Shalek, AK, Satija, R, Adiconis, X, Gertner, RS, Gaublomme, JT, Raychowdhury, R, Schwartz, S, Yosef, N, Malboeuf, C, Lu, D, Trombetta, JJ, Gennert, D, Gnirke, A, Goren, A, Hacohen, N, Levin, JZ, Park, H, Regev, A, “Single-cell transcriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immune cells,” Nature, 498(7453):236-240, 2013.

延伸閱讀

單細胞分析之全攻略（上）