在定量PCR時，我們常常糾結一個問題，究竟是相對定量還是絕對定量呢？如今，你無需糾結了，因為數字PCR（digital PCR或dPCR）來了。盡管這兩種技術有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而dPCR則讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的絕對定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應用領域：拷貝數變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

數字PCR技術，是通過將微量樣品作大倍數稀釋和分液（partitioning），直至每個樣品中所含有的待測分子數不會超過1個，再將所有樣品在相同條件下進行PCR擴增，并對發生了擴增反應的樣品逐個進行計數的一種技術。

圖片來自Life Technologies

它是一種絕對測量方法，因為在這種條件下，只有含有1個目標分子的樣品才能被不斷放大至幾百萬倍的程度，其所產生的信號（例如熒光）將會非常強，以致可通過數個數的辦法進行絕對測量，其他樣品即使含有會產生干擾信號的雜質分子，但是由于雜質分子不可能發生PCR擴增，因此其信號將不可能達到能影響最終檢測結果的程度。

數字PCR的概念其實早在1999年就由Vogelstein和Kinzler提出，其初衷是為了能夠從大量的正常細胞中檢測出突變細胞，但由于當時能用于稀釋樣品的耗材只是384孔板，因此還不能非常好地體現數字PCR的優勢。

2006年，美國Fluidigm公司開發出第一臺商業化的數字PCR系統，它是基于集成流體通路（IFC）芯片。2010年，Life Technologies也推出了數字PCR產品線 – OpenArray系統。之后，QuantaLife公司開發出微滴數字PCR（ddPCR）技術，并因此獲得2011年度Frost & Sullivan北美新產品創新獎。2011年10月，Bio-Rad公司收購了QuantaLife和ddPCR技術，推出了QX100微滴式數字PCR系統。

Fluidigm與IFC芯片

Fluidigm公司結合微流體技術，生物技術和微電子等技術，于2006年底推出了Bio-Mark™ 高通量基因分析系統。其創新就在于集成液體通路技術：利用集成電路制作工藝（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，通過不同的控制閥門控制溶液在其中的流動來實現生物樣品的分液、混合、PCR擴增。集成流體通路技術極大地簡化了生物樣品和試劑的分液操作，提高分析通量和靈敏度，其納升級的反應體系為高通量的基因分析應用節省大量成本（試劑用量更少，樣品量更少）。

Bio-Mark™基因分析系統由Bio-Mark™實時PCR系統（整合了高性能計算機）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（將生物樣品、反應試劑導入到IFC微液流芯片中）和數據分析軟件四部分構成。IFC微液流芯片有2種：Dynamic Array（48.48動態芯片和96.96動態芯片）和Digital Array（12.765數字芯片和48.770數字芯片），應用于不同的基因分析中：拷貝數變化分析、遺傳突變檢測、基因分型、基因定量、單細胞基因表達等。

數字芯片將預混液（樣品與PCR試劑）分成數百個單獨的PCR反應，開展數字PCR分析。整個過程分為五步：準備芯片；將每個樣品預混液移液至芯片的獨立入口；將芯片放入IFC Controller，利用軟件界面迫使分析組分進入單獨的反應板；將芯片放入BioMark系統，開展熱循環和熒光檢測；利用分析軟件來查看和分析擴增曲線。

Fluidigm公司分子生物學主管Ramesh Ramakrishnan認為，數字PCR的流程顯然比傳統的qPCR更簡單，但通量較低。然而，數字PCR更特異，特別是在搜索稀有突變時。拷貝數變異分析就是一個很好的例子。采用12.765數字芯片，通過數字PCR，每個反應體系用量僅6 nL，可有效分辨12 與13 倍（或更高）的差異。

Fluidigm如今正努力讓微流體芯片變得更靈活，包括每個芯片的樣品量和每個樣品的分液數量。Ramakrishnan表示：“目前我們每塊芯片上能夠開展最多48個不同樣品的數字PCR，且每個樣品能夠分成770個單獨的反應倉。我們正在探索新的芯片形式，以便更改每塊芯片的樣品數量以及每個樣品的反應倉數量。”（未完，待續）

（生物通 余亮）