Western Blot是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析的*常用的技術(shù)之一，在RNAi篩選和藥物篩選磷酸化分析中往往涉及到高通量的Western Blot操作。這樣的實(shí)驗(yàn)通常是對(duì)2種以上的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)（內(nèi)參蛋白與目的蛋白，總蛋白與磷酸化蛋白），化學(xué)發(fā)光法需要Strip，且定量不準(zhǔn)確，膜上操作步驟繁瑣，涉及到細(xì)胞裂解、電泳、轉(zhuǎn)膜等諸多環(huán)節(jié)。In-Cell Western™ Assay則直接將微孔板內(nèi)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)甲醛固定、透化、孵育一抗二抗并洗滌等簡(jiǎn)單步驟，*后直接將微孔板掃描成像。In-Cell Western的相對(duì)靈敏度同于或好于膜上的Western，由于省去了多個(gè)手動(dòng)步驟而減少了實(shí)驗(yàn)誤差，使得Intra-Assay和Inter-Assay的重復(fù)性都大為提升。

一、In-Cell Western原理、實(shí)驗(yàn)流程示意圖

    用微孔板培養(yǎng)細(xì)胞后直接將板內(nèi)的細(xì)胞用甲醛固定、透化后孵育一抗二抗，洗滌后直接將微孔板掃描成像。

二、In-Cell Western相對(duì)膜上Western的操作步驟大為簡(jiǎn)化

    In-Cell Western用紅外標(biāo)記的二抗直接標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的蛋白，可定量每個(gè)微孔內(nèi)的總熒光量。在In-Cell Western分析中，省略了細(xì)胞裂解物的制備，制膠，電泳以及轉(zhuǎn)膜等這些費(fèi)時(shí)又易于產(chǎn)生錯(cuò)誤的步驟，避免了細(xì)胞裂解過(guò)程的不穩(wěn)定性和人工產(chǎn)物的干擾，并且可同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)。雙色檢測(cè)使定量更為精確，同時(shí)由于一般的酶檢測(cè)方法針對(duì)的是純化過(guò)的蛋白，因而這種細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)結(jié)果能提供更多更準(zhǔn)確的信息量。

三、為什么選擇雙色近紅外熒光技術(shù)？

    相對(duì)于化學(xué)發(fā)光法，熒光信號(hào)的線(xiàn)性范圍更加寬廣，定量準(zhǔn)確，而一般的熒光染料不能直接用于檢測(cè)膜上的蛋白或者塑料培養(yǎng)皿中的蛋白，因?yàn)樗鼈兊募ぐl(fā)和檢測(cè)波長(zhǎng)位于可見(jiàn)光譜區(qū)，從而容易產(chǎn)生高背景熒光干擾。近紅外熒光（670-1100 nm）染料在長(zhǎng)波下它的背景熒光很低，具有很好的信噪比。Odyssey紅外激光檢測(cè)系統(tǒng)利用這一原理，系統(tǒng)同時(shí)發(fā)出兩種紅外波長(zhǎng)的激光進(jìn)行檢測(cè)，其內(nèi)部含有兩個(gè)激光二極管，分別產(chǎn)生兩種波長(zhǎng)的激光（680nm和780nm），另外還有兩個(gè)激光檢測(cè)器，分別檢測(cè)720nm和820nm波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，該系統(tǒng)可以用于檢測(cè)膜上和微孔板上的蛋白或核酸。在此基礎(chǔ)上，雙色熒光則可同時(shí)檢測(cè)2種以上的靶蛋白，尤其適用于磷酸化分析。除此之外，用紅外染料標(biāo)記的抗體，在不同的波長(zhǎng)下可一次同時(shí)檢測(cè)膜或微孔板上的多種蛋白分子，并由于熒光信號(hào)強(qiáng)度和蛋白的豐度或含量具有很好的線(xiàn)形相關(guān)性，它不同于化學(xué)發(fā)光法是一種基于酶促反應(yīng)，其檢測(cè)易受到諸多因素影響而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確，因此可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。這是化學(xué)發(fā)光法和同位素技術(shù)所無(wú)法完成的。

四、雙色I(xiàn)n-Cell Western分析

 
    將A431細(xì)胞接種于96孔板上培養(yǎng)，細(xì)胞用100 ng/ml的EGF處理15分鐘。處理完畢后，將細(xì)胞用4%的甲醛/PBS室溫固定20分鐘，再用0.1% Triton X-100/PBS洗滌3次。兔抗和鼠抗分別作用于總ERK和磷酸化的EKR，羊抗兔抗體用Alexa Fluor® 680標(biāo)記，羊抗鼠抗體用IRDye 800標(biāo)記，因而總ERK（紅色）和磷酸化的ERK（綠色）被直觀的顯示出來(lái)。以總蛋白作為內(nèi)參，對(duì)ERK蛋白的磷酸化進(jìn)行定量分析。

五、小結(jié)

    In-Cell Western相對(duì)于膜上Western而言，省去了細(xì)胞裂解、電泳、轉(zhuǎn)膜等繁瑣步驟，降低了引入實(shí)驗(yàn)誤差的風(fēng)險(xiǎn)，故而其Intra-Assay和Inter-Assay的重復(fù)性均好于膜上的Western，如此提高了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性和可信度，是高通量分析蛋白表達(dá)時(shí)的理想方法。

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