檢測(cè)藥物分子與血漿蛋白或組織蛋白的結(jié)合程度是藥物開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵階段，因?yàn)樗幬锱c血漿蛋白或組織蛋白的結(jié)合程度對(duì)藥物劑量、效能、清除率以及可能的藥物相互作用均會(huì)產(chǎn)生重要影響。平衡透析法是研究藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，通過(guò)該方法可以定量地討論藥物分子與蛋白質(zhì)結(jié)合的結(jié)合數(shù)量、結(jié)合常數(shù)。

平衡透析是用透析膜將蛋白質(zhì)溶液與緩沖液分隔開(kāi)，在兩者之間建立一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物分子可以通過(guò)（圖1）。透析的動(dòng)力是擴(kuò)散壓，擴(kuò)散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質(zhì)在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關(guān)。

 
圖1. A. 含有緩沖液的對(duì)照樣品與含有蛋白的待測(cè)樣品之間的平衡透析示意圖。 B. 緩沖液室（B）和樣品室（S）內(nèi)，藥物濃度隨時(shí)間的變化。對(duì)照樣品中，藥物被加入一個(gè)透析室內(nèi)，使其擴(kuò)散。4小時(shí)后，達(dá)到平衡時(shí)，兩個(gè)透析室內(nèi)的藥物濃度是相等的。待測(cè)樣品中，藥物連同與其具有相互作用的蛋白被加入樣品室內(nèi)，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，由于藥物與蛋白發(fā)生了結(jié)合，留存于樣品室（S）內(nèi)的藥物量是藥物總量的75%。

盡管被認(rèn)為是研究藥物分子與蛋白質(zhì)相互作用的首選手段，但以往的平衡透析方法卻耗時(shí)費(fèi)力、成本高昂，也不易于自動(dòng)化操作，為藥物開(kāi)發(fā)帶來(lái)種種問(wèn)題。

為此，賽默飛世爾科技與制藥行業(yè)緊密合作，開(kāi)發(fā)出Thermo Scientific RED快速平衡透析系統(tǒng)和最新的競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)。這些系統(tǒng)不僅可解決傳統(tǒng)平衡透析系統(tǒng)帶來(lái)的人力、時(shí)間、成本及與自動(dòng)化平臺(tái)兼容性等問(wèn)題，還可以加速藥物先導(dǎo)物的優(yōu)化、降低損耗等。

與以往的平衡透析系統(tǒng)相比，RED系統(tǒng)采用一次性透析管，不需要預(yù)先浸泡、組裝或使用特殊儀器設(shè)備，更易于使用；透析膜的表面積/體積比率高，在劇烈震蕩時(shí)，100分鐘即可達(dá)到平衡；200rpm震蕩時(shí)，3-4小時(shí)可達(dá)到平衡；且靈活性高，一次實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)1-48之間任意數(shù)量的樣品，而不必浪費(fèi)整塊板。RED系統(tǒng)使用96孔板模式，與自動(dòng)化液體處理工作站相兼容，且平板采用分區(qū)間隔設(shè)計(jì)，避免了樣品間的交叉污染或泄漏。RED系統(tǒng)經(jīng)過(guò)充分的驗(yàn)證，在檢測(cè)血漿蛋白結(jié)合率時(shí)，所得的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果高度一致（表1）。

諾華生物醫(yī)藥研究所的研究人員曾對(duì)RED系統(tǒng)進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)只需4小時(shí)即可確保平衡已達(dá)到。通過(guò)這段時(shí)間的孵育，RED系統(tǒng)產(chǎn)生了與文獻(xiàn)相當(dāng)?shù)难獫{蛋白結(jié)合數(shù)據(jù)。使用RED裝置的分析間和分析內(nèi)差異往往比標(biāo)準(zhǔn)平衡透析更低。他們認(rèn)為，RED方法生成了可靠且準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，分析制備時(shí)間更短，且易于自動(dòng)化。

表1. Thermo Scientific RED系統(tǒng)測(cè)得的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果比較。

傳統(tǒng)的Thermo Scientific RED快速平衡透析系統(tǒng)

傳統(tǒng)的RED系統(tǒng)由一次性透析管和可重復(fù)使用的96孔板底座構(gòu)成，透析膜面積大，可使透析加速。獨(dú)特設(shè)計(jì)的96孔板底座由優(yōu)質(zhì)PTFE制成，可與自動(dòng)化液體處理工作站兼容。每塊板帶有48組透析管，每一組透析管由兩個(gè)并排的、獨(dú)立的透析室組成，透析室由截留分子量為8K的柱形透析膜分開(kāi)，該透析膜經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，可確保最低的非特異性結(jié)合。

Thermo Scientific 一次性RED系統(tǒng)

與傳統(tǒng)RED系統(tǒng)不同的是，一次性RED系統(tǒng)是由一次性聚丙烯96孔板底座和預(yù)先裝配進(jìn)底座的48組平衡透析管組成。這種形式對(duì)使用放射性材料的實(shí)驗(yàn)室特別方便，因?yàn)?6孔板底座用后無(wú)需清洗，避免了污染的風(fēng)險(xiǎn)。至于透析管和透析膜，則與傳統(tǒng)RED系統(tǒng)相同。

一次性RED系統(tǒng)已經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，使用該系統(tǒng)檢測(cè)化合物與人血漿蛋白的結(jié)合率，對(duì)高、中、低結(jié)合率的化合物均做了測(cè)試，所得結(jié)果與傳統(tǒng)RED系統(tǒng)（底座由PTFE材質(zhì)制成）、以及文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相當(dāng)。

RED快速平衡透析系統(tǒng)可應(yīng)用在以下方面：

† 請(qǐng)?jiān)L問(wèn)www.thermo.com/pierce，查看實(shí)驗(yàn)方案示例

新產(chǎn)品！Thermo Scientific競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)

除了傳統(tǒng)的RED系統(tǒng)，賽默飛世爾科技還推出了全新的競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)。此系統(tǒng)由一次性透析管和可重復(fù)使用的PTFE底座組成。底座的獨(dú)特設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)將3至15個(gè)透析室置于同一底座中，以幫助研究人員同時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)底座的大小與標(biāo)準(zhǔn)的96孔板相同，每個(gè)孔位的大小為9x9mm。此外，透析管的反應(yīng)體積小，透析表面積大，可實(shí)現(xiàn)快速透析，在大約4小時(shí)左右達(dá)到平衡。

多室透析系統(tǒng)的設(shè)計(jì)理念模擬了未結(jié)合的藥物從血漿向不同組織擴(kuò)散的情形，留在血漿內(nèi)的、未結(jié)合藥物的量在反應(yīng)體系的各個(gè)部分都是相同的。下圖顯示的是多個(gè)透析室浸在血漿中。空白緩沖液槽可以提供達(dá)到平衡時(shí)游離藥物的濃度信息。

 
競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)能夠在體外同時(shí)檢測(cè)2-15種不同組織的蛋白與目標(biāo)分子的結(jié)合率，且重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高。在ADME-Tox研究中，它可用于候選藥物的初篩，轉(zhuǎn)入體內(nèi)研究之前，在體外檢測(cè)藥物在血漿和多種組織中的分配（圖2）。它還適用于臨床前研究階段，對(duì)新化合物進(jìn)行hit-to-lead的篩選。

 
圖2. 檢測(cè)藥物分布的實(shí)驗(yàn)示例。包裝規(guī)格為10個(gè)的競(jìng)爭(zhēng)型RED透析管，帶有8個(gè)雙室透析管和2 個(gè)單室透析管。在單室透析管的中的開(kāi)放室，可直接接觸到底板中的待測(cè)樣品，而不需將整個(gè)透析裝置拆開(kāi)。

此外，賽默飛世爾科技還推出了為蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)特別設(shè)計(jì)的Thermo Scientific Pierce蛋白沉淀板。它可在10-30分鐘內(nèi)制備用于HPLC或LC-MS的小分子樣品，與RED系統(tǒng)和競(jìng)爭(zhēng)型RED系統(tǒng)無(wú)縫整合。這種沉淀板的原料為無(wú)浸出的疏水材質(zhì)，有效預(yù)防堵塞，且與大多數(shù)有機(jī)溶劑相兼容。通過(guò)抽真空、正壓或離心等方法都可收集濾液，簡(jiǎn)便易行。

Thermo Scientific RED系統(tǒng)為研究藥物分子與蛋白質(zhì)的相互作用提供了一種簡(jiǎn)單易用且可靠的工具，讓研究人員可加速先導(dǎo)化合物的優(yōu)化。若您對(duì)RED系統(tǒng)有興趣，請(qǐng)點(diǎn)擊此處索取更多資料。（生物通 余亮）

參考文獻(xiàn)
1. Jusko, W.J. and Gretch, M. (1976). Plasma and tissue protein binding of drugs in pharmacokinetics. Drug Metab. Rev., 5(1), 42-139.
2. Colangelo, P.M., et al. (1992). Age and propranolol stereoselective disposition in humans. Clin. Pharmacol. Ther., 51, 489-94.
3. Chan, E., et al. (1994). Disposition of warfarin enantiomers and metabolites in patients during multiple dosing with rac-warfarin. Brit. J. Clin. Pharmacol., 36, 563-569.

為Thermo Scientific RED系統(tǒng)投上一票吧！