大腸桿菌表達蛋白的種種優點不必贅述。然而讓許多研究者深感頭疼的是在破菌過程中，機械法不可避免的產熱、剪切力和氣泡等對嬌弱寶貴的蛋白造成巨大損失！有什么方法能溫和、高效率地抽提活性蛋白、保持其天然結構，而且比酶法重復性好，易于放大和平行操作？這個偉大的工具已經上市啦！她就是默克密理博Novagen的BugBuster Master Mix！有人甚至親切地稱之為BugBuster MM。

BugBuster®蛋白抽提試劑

BugBuster®蛋白抽提試劑可溫和破碎大腸桿菌細胞壁，并釋放可溶性蛋白，可以替代機械方法，如弗氏壓碎或超聲處理等激烈處理，具有簡單、快速、低成本的特點，抽提的蛋白可直接用于純化或其它后續實驗。該專利配方采用去污劑混合物，能夠使細胞壁穿孔，同時保持蛋白活性。

實際操作時將離心收集的細胞懸于BugBuster中，此時加入Benzonase®核酸酶可降低抽提物中由于染色體釋放而導致的高粘度，加入高度特異性的rLysozyme溶液，可以通過水解細胞壁中N-乙酰胞壁酰胺鍵，導致細胞壁破裂，從而提高蛋白抽提效率，尤其對于大的蛋白質的抽提。簡單孵育后，離心去除不可溶的細胞碎片。澄清的抽提物可以直接使用Novagen的親和介質（包括GST•Bind、GST•Mag、His•Bind、His•Mag和S•Tag樹脂）或其他層析基質純化。結合到親和樹脂上后，過量的BugBuster可通過用相應緩沖液洗柱子輕易去除。在表達蛋白不可溶時，BugBuster也可用于制備高純度包涵體。

標準的BugBuster是1× 的Tris緩沖液體，室溫穩定。500ml試劑與10000U Benzonase®核酸酶同時提供，以制備低粘度抽提物并從蛋白制備物中去除核酸。BugBuster和Benzonase與普通蛋白酶抑制劑兼容。

BugBuster Master Mix

BugBuster Master Mix是按最佳配比預混了BugBuster蛋白抽提試劑、Benzonase®核酸酶以及rLysozyme溶液。這種方便型試劑可以從革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌中最大程度地抽提活性可溶蛋白。預混試劑不僅省去了多次計算、添加試劑的麻煩，還可非常方便地根據起始樣品等比例縮放試劑用量。默克密理博還提供中英文操作說明書，相當貼心。兩種包裝分別滿足從20g和200g細胞糊中抽提蛋白。

 
E.coli裂解細胞方法的比較

從500ml經誘導的、帶有編碼GST的pET-41a(+)的BL21(DE3)培養體系中取出50ml樣品，離心收集細胞并分別重懸于2ml 1×PBS緩沖液，另一市售蛋白抽提試劑以及BugBuster®試劑。用PBS重懸的樣品用超聲波10pulses（脈沖）50％duty共處理30s。用裂解試劑遵從相應操作說明書操作。抽提效果是經過離心后用Novagen的GST•Tag分析試劑盒檢測GST酶活來評價的。

Tips：

為什么BugBuster Master Mix是做原核表達蛋白抽提的最佳選擇？

活性大蛋白：大蛋白、有活性的蛋白（如GST•Tag融合蛋白）在抽提時要相當小心。為了獲得更高的得率并確實保持蛋白的活性，建議避免超聲等機械破菌操作帶來的熱效應、剪切作用及產生氣泡等對蛋白的破壞作用。BugBuster MM極其溫和高效，且專一地去除核酸，降低樣品的粘度，使每次蛋白抽提、純化都能獲得穩定的產量和活性。

高通量、多樣本的平行實驗：在做“蛋白誘導表達條件-產量”等平行評估實驗，或突變體平行表達評估等實驗時，杜絕超聲不足或過度造成的蛋白得率系統誤差至關重要。只需按細胞沉淀量平行加入BugBuster MM，即可獲得最佳重現性和平行性的數據，操作非常高效。

擴大發酵：縮放發酵規模需要重新摸索烈菌條件，而BugBuster方法只需通過簡單的線性計算，根據實際發酵體積相應增加裂解試劑用量即可，在表達體積很小時甚至更具優勢。

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