幾年前，若提到microRNA（miRNA），大家可能還是一臉茫然，但現(xiàn)在它們卻儼然生命科學(xué)世界的明星。這些RNA分子雖然很小（21-25 nt），容易被人忽略，卻在基因表達的調(diào)控中扮演了重要的角色。我們所認識的miRNA也越來越多。最新版（14.0）的miRBase數(shù)據(jù)庫中收錄的microRNA序列信息首次超過10,000條，其中人基因組中已鑒定出721條。成熟miRNA的表達是組織特異性的，miRNA的豐度可能相差幾個數(shù)量級。更重要的是，miRNA表達的失調(diào)可能會引發(fā)癌癥。因此，眾多疾病研究實驗室都爭相繪制癌癥的miRNA表達圖譜，來了解miRNA的調(diào)控作用，并尋找癌癥的標志物。

繪制miRNA圖譜，芯片當然是首選。但miRNA在三個方面與mRNA不同：(1) miRNA是相當小的分子，豐度差異較大；(2) 成熟miRNA與其前體pre-miRNA和pri-miRNA共存，只是長度不同；(3) 許多miRNA序列非常接近，比如同源分子，只有一個或幾個核苷酸的差異。因此，常規(guī)芯片技術(shù)不能直接分析這些分子。目前市場上已經(jīng)有不少miRNA芯片產(chǎn)品，但有些較繁瑣，需要預(yù)分離microRNA，有些則缺乏分辨力，不能區(qū)分同源之間的差異。

現(xiàn)在，生物通帶你了解一種新產(chǎn)品-美國Signosis公司的miRNA Array。我們之所以關(guān)注它，還是源于《Science》雜志的介紹。“基于T7-寡核苷酸連接分析的miRNA檢測芯片，使用戶用更少的花費去評估m(xù)iRNA 的表達。多種miRNA表達可通過一個簡單的試驗同時進行測定。該方法可完美地鑒別只有一個核苷酸差異的同源miRNA，進而可區(qū)別出所有同源的miRNA。捕獲的miRNA再進行T7擴增，不會出現(xiàn)PCR方法所導(dǎo)入的偏差。總RNA可以直接使用，無需預(yù)分離miRNA。”以上這段話譯自2008年5月9日（Vol 320）的《Science》雜志。

仔細琢磨一下，發(fā)現(xiàn)Signosis的芯片設(shè)計還真是有些巧妙。它融合了引物連接分析（oligo Ligation Assay）和以T7轉(zhuǎn)錄為基礎(chǔ)的線性擴增，開發(fā)出專利的T7-OLA技術(shù)（圖1）。對每一個miRNA分子，有二條引物（oligo）來識別，每條引物只識別miRNA一半的序列。其中的一條引物中含有Tag序列，另外一條引物含有T7啟動子序列。只有序列完全匹配的時候，兩個引物才能和miRNA雜交，形成RNA/DNA的雜合體。即使只有一個核苷酸不匹配，都會造成雜交或者隨后連接的失敗。這也是T7-OLA技術(shù)可分辨同源miRNA的原因。

由于miRNA分子太小，這個DNA/RNA雜合體可能不太穩(wěn)定，因此引入了疊加序列。通過引物及互補序列的延伸，雜合體分子的穩(wěn)定性增加。含有生物素（biotin，B）的短序列互補結(jié)合到其中的一條引物上。通過結(jié)合有親和素（Streptavidin）的磁珠分離出雜合體。然后，兩引物在T4連接酶的作用下，被連接成一條DNA片斷。隨后經(jīng)過線性擴增（轉(zhuǎn)錄），含有生物素的UTP整合到RNA序列中。把轉(zhuǎn)錄好的RNA序列和預(yù)先準備好的含有不同miRNA序列的膜，進行雜交。最后加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的親和素進行反應(yīng)，加入發(fā)光底物測定。

圖1. miRNA 芯片分析的流程圖。

雖然上面羅羅嗦嗦說了很多種oligo，但實際操作卻相當簡單，只有三步：(1) 將總RNA或預(yù)分離的miRNA樣品與提供的引物混合，形成RNA/DNA雜合體；(2) 用磁珠選出雜合體，除去游離的寡核苷酸，在miRNA引導(dǎo)下兩引物連接成一個DNA片斷；(3) 通過T7轉(zhuǎn)錄，擴增連接的DNA片斷。之后就是雜交和檢測了。目前Signosis公司提供多種miRNA芯片試劑，包括人、小鼠、大鼠、干細胞、腫瘤以及凋亡相關(guān)。人miRNA芯片試劑有60-72個點；腫瘤miRNA芯片試劑有132個點；小鼠miRNA芯片試劑有119個點；大鼠miRNA芯片試劑有113個點。據(jù)了解，更多功能方向的miRNA芯片以及檢測更多miRNA的芯片正在研發(fā)中，這將促進miRNA芯片在探索miRNA差異表達方面的應(yīng)用。

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近幾年，研究人員大量繪制與癌癥發(fā)生相關(guān)的miRNA表達圖譜，希望從中找到診斷及治療的線索。美國Wistar研究所的研究人員就鑒定出兩種能夠促進腫瘤擴散或轉(zhuǎn)移的miRNA分子。其中一個miRNA分子還可能為乳腺癌轉(zhuǎn)移的早期預(yù)防提供信息，并且有助于這種癌癥的治療。miRNA還可能是白血病的治療靶標。另外，治療丙型肝炎的首個miRNA藥物也已進入臨床。如果你也在從事此類研究，相信miRNA表達圖譜能幫你不少忙。

array分析是一種多重的分析，可以同時測定多個分子，但其結(jié)果需近一步確認，Northern blot是確認這些發(fā)現(xiàn)的最常用方法。此外，并非所有人都想繪制miRNA的表達圖譜，有時我們只對某幾個特別感興趣。這時也可以用Northern blot。它簡單易行，大部分實驗室都可以操作。但Northern分析也有不少缺陷：很難鑒別同源miRNA，靈敏度不高，操作繁瑣。

針對這些問題，Signosis開發(fā)出專利的miRNA微孔板檢測試劑。在miRNA微孔板檢測中，一個miRNA分子通過二個連接oligo分別與捕獲oligo、生物素化的檢測oligo連接。雜交體通過與固相化的捕獲oligo雜交固定在微孔板上，再由辣根酶標記鏈酶親和素和發(fā)光底物檢測，這種雜交體結(jié)構(gòu)對miRNA分子序列非常敏感，即使一個核苷酸的差異也會阻止雜交體的形成，從而可分辨同源miRNA。而且該方法的敏感性也比Northern blot高。此外，這種微孔板檢測非常簡便，就像ELISA實驗一樣，只需加樣、孵育、洗滌，而省去了繁瑣的轉(zhuǎn)膜和雜交。

圖2. miRNA微孔板分析示意圖。

另外，Signosis公司還提供了miRNA 螢光素酶報告載體，靶基因報告載體，Northern blot分析試劑盒（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=13）等產(chǎn)品，以供全方位的miRNA研究。

總結(jié)

基于T7-OLA專利技術(shù)的miRNA芯片（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=8）具有以下優(yōu)點：
• 分辨力強---能分辨所有同源的miRNA ，所有同源的let7可清楚分辨；可分辨前體miRNA和成熟miRNA
• 線性擴增---捕獲的miRNAs被T7轉(zhuǎn)錄擴增，沒有PCR擴增引入的偏差
• 勿需預(yù)純化---總RNA可以直接進行分析，勿需預(yù)分離
• 操作簡單---步驟簡單、流暢

miRNA微孔板檢測試劑（http://www.hongxinbio.com/products.asp?id=93）具有以下優(yōu)點：
• 操作簡單---做miRNA試驗就像做ELISA試驗，無需用酶轉(zhuǎn)換miRNA成cDNA，檢測步驟只是孵育和洗滌。
• 靈敏度高---較miRNA Northern blot分析敏感1000倍。
• 分辨力強---在分辨同源miRNA 時，較Northern blot有更高的分辨力。
• 差別定量---二個或二個以上特定miRNA表達的差異可定量分析。

（生物通 薄荷）