作者：Christopher Bird 與 Shelli Kirstein
美國印第安納州印第安納波利斯羅氏公司應用科學部羅氏診斷。通訊作者聯系地址：S.K.（shelli.kirstein@roche.com）。

本文譯自2009年8月的《自然-方法學》

對于進行浸潤與遷移分析的研究人員來說，使用羅氏應用科學部xCELLigence RTCA DP儀器，以及CIM-Plate 16，通過建立在阻抗基礎上的技術方法，可對細胞反應進行實時監測，而不需要進行外源性標記處理。CIM-Plate 16 可對實驗期間細胞反應情況進行動態監測，對細胞浸潤與遷移的發生以及浸潤及遷移率進行詳細觀測。這種監測信息可幫助研究人員理解細胞反應過程，對細胞反應過程進行如此精細的監測，是目前終點實驗所無法做到的。

細胞浸潤與遷移分析原理
對細胞浸潤與遷移的研究，在更好地理解潛在的生物與分子機制方面，具有非常重要的價值。羅氏應用科學部最新的CIM-Plate 16產品，可對細胞浸潤與遷移進行實時檢測，而不需要進行額外的標記處理。

細胞浸潤是指細胞尤其是癌細胞對周邊組織的侵入與破壞。細胞遷移是指細胞由一個區域移動至另外一個區域，通常是對化學信號所做出的反應，在各種生理與病理過程中，包括胚胎發育、細胞分化、傷口愈合、免疫反應、炎癥，尤其是癌癥轉移過程中，非常重要。

用于遷移檢測的常規方法是建立在終點與標記基礎上的實驗方法。其中一種最常用的實驗方法是Boyden chamber實驗 （也被稱為 trans-well 小室遷移檢測實驗），該實驗中，細胞被放置于間隔上室中，細胞可通過一種人造微孔濾膜進行浸潤與遷移，并可浸潤或遷移至間隔下室中，間隔下室中含有一種化學趨化物質。

這種方法也有缺陷，必須使用化學染料對遷移的細胞（通常是濾膜反面的細胞）進行染色處理，或使用熒光分子對遷移細胞進行標記處理。大多數情況下，是將濾膜間隔去除，并繼而使用顯微鏡對染色或標記細胞進行手動計數，或使用一種分光光度儀對染色或標記細胞進行評價。這種方法比較耗費人力，因此限制了實驗通量，而且，由于進行細胞標記處理，可能會導致基因表達情況的改變，由于標記效率本身的差異性，也可導致實驗之間變異情況的發生。而且，顯微鏡細胞計數并不準確，通常可導致檢測結果前后不一致，細胞遷移數據不具有重現性。

圖 1 | CIM-Plate 16 產品用于實時細胞侵襲/遷移分析。(a) 圖示。檢測板以具有兩個隔離部分為特征，實驗設置較容易。(b)實際產品是塑料制品。
 
CIM-Plate 16 實時細胞侵襲/遷移分析
與上述方法相反，羅氏xCELLigence實時細胞分析儀（RTCA） DP儀器可通過動態記錄整體細胞浸潤與遷移過程，提供關于細胞遷移的動態信息，而不需要進行標記處理，顯著改善了浸潤與遷移實驗性能。 RTCA DP 儀器使用的是CIM （Cell Invasion and Migration）-Plate 16，以類Boyden小室微孔聚對苯二甲酸乙二酯（PET）膜朝下的一面上具有集成微電子傳感器為特征（圖 1）。化學趨化物質的趨化作用下，上層間隔小室細胞可通過微孔膜從上層小室遷移至底層小室，遷移過程中，細胞可與微孔膜朝下一面上的電子傳感器接觸并可粘附至傳感器上，從而導致電阻增加1。電阻增加的程度與微孔膜朝下一面上的遷移細胞的數量之間具有相關性，使用RTCA DP儀器持續并自動記錄反映電阻變化情況的細胞指數值（圖2與3）。因此，可通過細胞指數情況對細胞遷移活動進行監測。

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實驗設計
以下是于RTCA DP儀器上，使用胎牛血清（FBS）作為化學趨化性物質，進行的一種基礎性遷移實驗方案。對該實驗方案進行優化處理，以用于兩種癌細胞系：人纖維肉瘤細胞系，HT1080，以及一種人宮頸癌細胞系，Hela。如果使用的是不同類型的細胞系或化學趨化性物質，則需要對實驗條件進行進一步的優化處理。（i）細胞應該于不含血清培養基中生長，并生長4-24小時。（ii）對于侵襲性實驗來說，將培養基（含有或不含化學趨化性物質）加入至底層小室前，對CIM-Plate 16頂層小室進行Matrigel（BD）包被處理。（iii）將頂層小室置于底層小室上面，并將兩者扣合在一起，以進行CIM-Plate 16的裝配。（iv）在獲得背景測定前，將不含血清培養基放置于頂層小室中進行水合處理，并將過濾膜放置于CO2孵育箱中，37℃環境下，1個小時，進行預孵育處理。（v） 于不含血清培養基中，對細胞進行輕柔的胰酶消化處理，使細胞成團狀，然后再重新懸浮細胞。（vi） 對CIM-Plate 16 進行平衡處理后，將CIM-Plate 16放置于RTCA DP儀器工作站中，并進行背景細胞指數值測定。（vii）然后從RTCA DP儀器站中移除CIM-Plate 16，并將細胞加入至頂層中，細胞密度為理想密度。（viii） 將CIM-Plate 16放置于RTCA DP 儀器站中，并在幾小時內，每隔2分鐘對細胞遷移情況進行監測。

HeLa 細胞遷移
我們對底層小室中含有或不含有10%FBS培養基中的兩種密度的HeLa 細胞進行了分析（圖 2）。由RTCA DP儀器對細胞遷移動力學情況進行記錄，共記錄18小時。通過自動實時監測，很容易區分并檢測出細胞遷移動力學情況。細胞指數值可反映出種植密度情況，通過細胞指數值測定可對較低及較高的種植密度情況進行定量監測。這樣測定出的細胞計數值與實驗終止時，通過對細胞進行固定與染色處理，而手動測定的細胞計數值之間具有相關性。

圖 2 | 通過對活細胞遷移進行持續監測所顯示的HeLa細胞遷移動力學。結果表達為均值±標準差(n = 4)。插圖為實驗結束后微孔濾膜朝下一面染色的遷移細胞的具有代表性的成像圖（使用Diff-Quick染色試劑盒； Fisher）。標尺：1630 μm。

HT1080 細胞浸潤與遷移
添加入10%的FBS后，我們分別對含有以及不含有Matrigel情況下的細胞侵襲與遷移動力學情況進行了監測（圖3）。無血清情況下，我們觀察到無或極少見細胞遷移情況發生。正如細胞指數所反映的，細胞侵襲與遷移受到Matrigel濃度的影響，細胞侵襲與遷移表現為劑量依賴性。通過對目前遷移情況的評估，以及實時監測，可較為容易地對細胞侵襲的發生與幾率進行定量測定。細胞指數信號的延遲（圖 3） 是由于細胞通過Matrigel侵襲所需時間的延擱，并取決于所使用的Matrigel的濃度。

圖 3 | 使用FBS作為化學趨化物質，在指定Matrigel稀釋液中，HT1080細胞的浸潤與遷移動力學。在未包被孔（遷移）或Matrigel包被孔（侵襲）中，HT1080細胞的種植密度是2 × 104個細胞每孔。結果表達為均值±標準差(n = 4)。預包被處理于37℃環境下進行，處理時間為4小時。

結論
特異于化學趨化物質刺激或matrigel濃度，癌細胞顯示出不同的遷移與侵襲特性。新的RTCA DP 儀器的CIM-Plate 16是進行細胞侵襲與遷移分析的一種通用產品，目前也是唯一的一種在不進行外源性標記情況下，可實時對細胞侵襲與遷移進行定量測定的產品。該產品可進行侵襲與遷移時間點確定，可有助于通過縮短實驗時間而增加實驗通量，最小化終點實驗數量并有助于確定抑制劑研究的最佳時間點。而且，使用xCELLigence 系統進行分析可減少手動細胞操作步驟，從而使檢測結果更加接近生理狀態。

預計在2009年的秋天，CIM-Plate 16 將上市。關于xCELLigence系統詳細信息請訪問http://www.xcelligence.roche.com/。

僅用于生命科學研究。XCELLIGENCE是羅氏公司的一個商標。Matrigel 是Becton、Dickinson 公司的一個商標。其他品牌或產品名稱則是各自所有者的商標。

1. Solly, K., Wang, X., Xu, X., Strulovici, B. & Zheng,W. Application of real-time cell electronic sensing （RT-CES） technology to cell-based assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 363–372 （2004）.
                                                 
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