定量PCR能分析蛋白嗎？你肯定會說，開玩笑。不過這是千真萬確的，一向以創(chuàng)新著稱的美國應用生物系統(tǒng)公司剛剛推出了TaqMan® Protein Expression Assays，首次應用TaqMan® 分析與實時定量PCR來定量蛋白表達，能對有限數(shù)量的人胚胎干細胞培養(yǎng)物中的多能標志物進行快速輕松的鑒定及相對定量。

人胚胎干細胞的鑒定是一個新興的領域，直到現(xiàn)在，研究人員還需要使用頗費勞力的蛋白分析技術，如流式細胞術、免疫染色及western blot分析。這些方法不夠靈敏，本身也很難定量。TaqMan® 蛋白表達分析則采用一步法裂解樣品及簡化的實時定量PCR流程，3.5小時就能從樣品中獲得數(shù)據(jù)，而所需樣品量只有其他方法的1/100-1/10。

TaqMan® 蛋白表達分析利用金標準的TaqMan® 5’ 核酸酶試劑來定量蛋白表達，其工作流程和樣品量與普通的mRNA及microRNA分析相似。由于蛋白表達結(jié)果是來自相同的分析平臺，那么這些創(chuàng)新的分析能夠?qū)�mRNA和/或miRNA的表達與蛋白表達直接關聯(lián)。其它任一種蛋白定量分析方法都不具備這個能力。

新穎的原理
你一定很納悶這個試劑盒究竟是如何定量的。其實它是基于一項新穎的檢測方法，稱為PLA™ - Proximity Ligation Assay技術。PLA利用親和純化的抗體和實時定量PCR系統(tǒng)來定量檢測蛋白的存在，適用于含10-500個細胞的裂解液。

首先將細胞裂解，然后與抗體-oligo-探針（就是帶了一段oligo尾巴的抗體）共同孵育。每個蛋白設計有兩個探針A和B。之后用DNA連接酶將兩段oligo連接起來，如圖1所示。經(jīng)過酶的滅活，就能夠進行實時定量PCR了。

這些預先設計的分析非常簡單且可靠，沒有洗滌步驟，所需的細胞量比western blot方法低100-500倍。與傳統(tǒng)的TaqMan®基因表達分析一樣，TaqMan® 蛋白表達分析所得的數(shù)據(jù)很容易進行相對定量，且極其適合多能和分化干細胞中的標志物相對定量。

簡化的流程
TaqMan® 蛋白表達分析流程運用了簡單的一步法樣品裂解步驟，能釋放所有類型的蛋白，此步驟與TaqMan®試劑結(jié)合，創(chuàng)造出高度靈敏而特異的過程，來測定少量樣品中的蛋白表達。整個實驗過程，從樣品到數(shù)據(jù)，在3.5小時內(nèi)就能完成（圖2），操作時間僅為1.5小時。所有試劑都已為分析細胞培養(yǎng)物中的蛋白而優(yōu)化。樣品制備過程溫和，一步法細胞裂解用的是非離子型去污劑。隨后樣品能與任何蛋白表達分析試劑盒的分析探針混合，而分析探針的結(jié)合需要60分鐘。然后加入連接酶將寡核苷酸連接起來，接著是15分鐘的滅活或純化步驟，來消化所有蛋白。再通過單次的板轉(zhuǎn)移將試劑轉(zhuǎn)移到PCR平板上，進行快速實時定量PCR。

圖2. TaqMan®蛋白表達分析的詳細流程。每個反應孔只需要2 uL起始樣品（10-500個細胞/uL）。對于TaqMan®分析的步驟4，10 uL連接樣品再加上混合液，構(gòu)成了20 uL的實時定量PCR反應終體積。

便利易用的分析
預先設計的TaqMan® 蛋白表達分析是專為一些人蛋白靶點而開發(fā)，包括hICAM1、hCSTB、hOCT3/4、hNANOG、hSOX2和hLIN28，再加上支持試劑來監(jiān)測人胚胎干細胞的相對蛋白水平。TaqMan® 蛋白表達分析產(chǎn)品線還包括核心試劑盒、陽性與陰性對照樣品細胞裂解液試劑盒，以及免費的數(shù)據(jù)分析軟件。核心試劑盒中包含分析運行所需的所有試劑，包括連接體寡核苷酸、連接酶、通用的TaqMan®分析、新的TaqMan® 蛋白表達快速混合液，需要與每個蛋白表達分析試劑盒一起運行分析。

可靠的實時定量PCR平臺
TaqMan® 蛋白表達分析能夠在Applied Biosystems的任一臺快速實時定量PCR系統(tǒng)上進行，并在一小時內(nèi)得到實時定量PCR的結(jié)果。Applied Biosystems的實時定量PCR系統(tǒng)提供了強大的解決方案來滿足任何實驗室的需求，讓實時定量PCR比以往更容易開展。有了新一代軟件，這些系統(tǒng)使用簡單，當然，它們還有著Applied Biosystems無人可比的性能、質(zhì)量以及長期可靠性的記錄作為支持。關于我們快速實時定量PCR系統(tǒng)的完整產(chǎn)品信息，請登陸www.appliedbiosystems.com。

直觀的數(shù)據(jù)分析軟件
所有Applied Biosystems實時定量PCR系統(tǒng)所提供的精密軟件包有助于實驗設定、數(shù)據(jù)收集和分析性能測試。免費的TaqMan® 蛋白表達分析數(shù)據(jù)分析軟件工具可在www.appliedbiosystems.com/taqman4protein下載。

通過分析設計的創(chuàng)新改變，Applied Biosystems將TaqMan®分析與實時定量PCR的金標準特異性、靈敏度和重復性帶到了干細胞蛋白研究中。這會兒你終于相信定量PCR也能定量蛋白了吧。

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