前言

   能夠重復出科研領域中已經發表的結果，對于確認、證實科學發現是十分重要的。如果數據無法重復，那么是否有人會追隨這個工作就十分值得懷疑了。很多生物醫藥的研究都采用培養細胞來進行，這些細胞可能是從細胞庫（如美國ATCC，American Type Culture Collection）得來，也可能是受贈于其它研究人員。據估計，15-20%的時間里，實驗中所使用的細胞已經不是原來的細胞系，或者與其它細胞系發生了交叉污染(1-3)。ATCC，以及其它細胞庫（Coriell Institute for Medical Research, European Collection of Cell Cultures (ECACC), Deutsche Sammlung von Mikrorganismen and Zellkulturen (DSMZ), Japanese Collection of Research Resources）都收到過提交的“錯誤”的細胞系，盡管提交者把細胞系提交到上述機構之前，還經過了檢驗。然而，最終證實這些細胞系還是鑒別錯了(4,5)。此外，干細胞也可能被污染，作為干細胞賴以增殖的哺育細胞層，小鼠細胞很容易污染到干細胞中。顯然，細胞系遭到污染、特征鑒別錯誤，將會極大地威脅著基于這些細胞而發表的論文的質量和研究發現的正確性。為此，很多細胞庫現在都要對提交來的細胞系進行鑒定，并對細胞系之間的交叉污染進行監測。

 
             直到他們發現所使用的HeLa細胞系表達了Y染色體標記物之前，一切都進展得非常順利。

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關于此問題的歷史觀點

   HeLa細胞系建立于1952年，是第一個人源的癌細胞系。在隨后的15年里，陸續建立了多種不同組織的人源細胞系(6)。1968年，研究人員發現許多培養細胞的特征都與原始細胞株的特征不符。這是第一個證據，證明某種細胞培養方法可能會導致細胞出現不可預測的變化，或細胞特征被錯誤地辨識。無菌技術的進一步發展降低了交叉污染的可能性，幾乎沒有檢測方法能夠證明哪種細胞已經遭受了上述影響。然而，從那時起，操作快速而又成本低廉的標準化方法應運而生。雖然這些改進方法應該消除許多細胞間的交叉污染，但是，交叉污染仍然是一個突出問題。ATCC和其它細胞庫現在正對他們所提供的所有細胞系進行交叉污染監控和遺傳特征鑒定，但是對于絕大多數研究人員，在他們的研究中并不執行這些看似過分謹慎的鑒定程序。加利福尼亞大學伯克利分校的Gertrude Buehring 和其同事在2004年對接近500位生物學家進行了一項調查，發現事實上僅有不到一半的研究人員按部就班地對他們使用的細胞系使用任何一項常規技術進行驗證，如短串聯重復序列（STR）分析的DNA指紋圖譜（6）。如果所有的細胞系都不經檢驗和證明，則細胞系被錯誤地辨識將是一個非常嚴重的問題。

進行細胞系鑒定可節約時間和金錢

   除了會導致數據前后不一致或令人質疑外，交叉污染還會浪費時間和金錢。 Mordechai Liscovitch是一位以色列研究人員，他說他和其實驗室的研究人員在兩株乳腺癌細胞系（MCF-7和MCF-7/AdrR，現在被重命名為MCI/ADR-RES）上花了3年時間，他們開始認為這兩株細胞系是具有相關性的，但后來才發現這兩種細胞系實際上并不相關。盡管早在1998年，有些科學家就懷疑人們錯誤地判斷了這兩個細胞系的“身份”，但是直到最近才證實了這一論斷(4,7)。開始，人們都認為MCI/ADR-RES來源于乳腺癌細胞系MCF-7，而事實并不是這樣—它來源于卵巢癌細胞系OVCAR-8（7）。這三個細胞系都屬于NCI-60類，后者是藥物篩選所常規使用的細胞系(4)。

   Liscovitch 實驗室就曾放棄了論文的發表，就是因為使用了被錯誤辨識的細胞系而導致了錯誤的結論。然而，還有未知數量的研究工作已經發表，而這些結論是基于被錯誤辨識的細胞系而得出的。南加利福尼亞大學和洛杉磯兒童醫院兒科臨床研究所的Charles Patrick Reynolds建立了兒童癌細胞系，并使用已有的多個細胞系進行了抗癌藥物研究。 據他估計，已發表的細胞生物學文獻中，高達35-40%的論文都需要撤回，因為這些文獻中都含有無效數據。這一估計引起了美國天主教大學Roland Nardone的注意，他號召廣大研究機構進行細胞系的鑒定工作 — 美國國立衛生研究院（NIH）和美國癌癥協會這樣的主要機構應該將細胞系鑒定作為給予基金資助的條件，同時在主要雜志中發表的基于細胞培養的相關研究也需要進行細胞系的鑒定。他還要求對技術人員和科學家進行關于預防和檢查細胞系交叉污染的教育，包括對這些提議方針的相關專業團體認可機構、主辦會議和研討會的教育，以便于推進這一標準被廣泛接受。Nardone博士認為這些改變對科學研究至關重要，這一信念甚至使他參與創建了“全球細胞系鑒定認知月”[2008年5月] — 由一些專業科學家發起的活動，針對細胞系被廣泛地錯誤辨識和交叉污染所造成的混亂和浪費。

   少數機構已經認識到了交叉污染的問題，如ATCC（7）和FDA，這些機構要求對用于制藥領域的實驗中所使用的材料 — 諸如細胞系 — 應該進行“身份鑒定”和純度測試（8）。Nature雜志最近也要求報告新的人類胚胎干細胞系的文章提供STR指紋圖譜數據，但沒有對其它細胞系進行要求(4)。雖然一些雜志和基金組織認識到了細胞系被錯誤辨識的問題，但是他們還不確定如何能夠最好地解決這些問題。應該在什么時候要求研究人員確認細胞系身份，是在審核前還是審核后？用于證實作者的細胞系身份的參照資源從哪里來？

  細胞系被錯誤辨識不僅會浪費時間和金錢、導致結果前后不一或不可重復、或文獻被退回，還可能對人類健康產生潛在的威脅。藥物、疫苗和其它生物藥物都是以實驗室的研究發現為基礎而產生的，往往都是跟細胞培養相關�；�于誤導性的或虛假的數據而制造的藥物產品將會導致該藥品全面投產的延遲，同時還推遲了針對多種疾病的有效治療手段的推出。研發治療手段的時間越長，遭受疾病困擾的人數就越多。

基于STR的方法可以輕松、快速地鑒定細胞身份

  所有這些問題都可以通過價格低廉的方法來解決，這一方法目前被用于鑒定細胞系的標準程序，但是這一鑒定過程必須要進行。 Roderick MacLeod 及其同事在DSMZ發現約有90%的科學家在提交新細胞系時，忽視或拒絕細胞庫的要求，他們抵觸建立細胞系DNA指紋圖譜以備將來鑒定細胞系使用(5,7)。研究人員需要在他們從事研究的早期就接受教育，知道如何檢測種系內和種系間的交叉污染，并了解為什么這樣做會如此重要。

  在細胞培養中可以使用許多方法對交叉污染進行鑒定，如同功酶分析、染色體組分型、人淋巴細胞抗原（HLA）分型和擴增片段長度多態性（AFLP）的特征分析。但是，比較好的方法是STR圖譜法，此方法是在以DNA為基礎的法醫鑒定領域成功建立起來的。在ATCC，STR分析使用的是多重PCR（Promega PowerPlex®1.2系統），可以同時擴增8個STR位點加1個性別決定位點Amelogenin（10，11）。每個被分析的人源細胞系都有其獨特的DNA重復模式，因此通過與基礎圖譜進行比對，即可對每一批新細胞系的身份進行確證。STR方法防止了ATCC將其6個“錯誤”細胞系進一步傳播出去 — 因為經過STR分型后，發現原本來自女性的細胞系中存在著Y染色體特異的擴增產物。此研究團體希望STR圖譜技術能夠作為全球范圍的檢測并消除細胞系污染的參考技術。

圖1 . A：Cell ID™系統的等位基因大小范圍。使用Cell ID™系統擴增STR片段，使用不同的染料進行標記，通過毛細管電泳進行片段大小分離。每個樣本中都有一個標準品以確定被檢樣本的大小。JOE標記的位點為灰色。Fluorescein標記的位點為白色。CXR標記的內標600片段為黑色。B：K562細胞系DNA圖譜。使用Cell ID™系統擴增并進行毛細管電泳檢測后，樣本數據顯示為一系列染料標記的等位基因峰。

圖2. Cell ID™系統鑒定細胞系污染。 A：HEK293細胞系的STR圖譜。B：污染有29%HeLa細胞系的HEK293細胞系的STR圖譜。C：HeLa細胞系的STR圖譜。使用Maxwell® 16Cell LEV DNA純化試劑盒純化DNA，細胞數為104個，并使用Cell ID™系統進行擴增。擴增產物通過毛細管電泳進行分析。為了簡化問題，僅顯示了JOE標記的等位基因圖譜。

Cell ID™系統能夠為您提供基于STR的細胞系身份認證

   Promega公司是STR分型系統的主要供應商，在法醫和親子鑒定方面具有領先優勢，其PowerPlex®1.2 STR分析系統（PowerPlex® 1.2 STR analysis system）已經成為細胞培養機構進行細胞系鑒定的“金標準”。為了滿足使用更簡便地進行細胞系鑒定的需要，我們研發了Cell ID™系統（Cell ID™ System(a,b)），并對此系統進行了改進，提供了能夠成功而簡便地鑒定、鑒別人源細胞系和檢測種系內細胞系交叉污染的試劑。

  Cell ID™系統使用STR分型技術，同時擴增特異性強、具有高度多態性的10個位點（9個STR位點和性別識別位點Amelogenin；包括D21S11，TH01，TPOX，vWA，Amelogenin，CSF1PO，D16S539，D7S820，D13S317和D5S818），三色熒光標記。這些位點組合所提供的遺傳圖譜的隨機匹配概率為29.2億分之一。 該系統包括一個熱啟動的Taq DNA聚合酶，可以方便地在室溫條件下組裝反應組分。 擴增后，采用單次注射毛細管電泳對樣本進行分析，同時結合使用所提供的標準品，用以幫助確定不同位點的等位基因的大�。▓D2）。使用等位基因分析軟件確定遺傳圖譜。

  即使大多數科研人員所在的實驗室沒有進行STR分型的設備，他們仍可通過具備儀器（毛細管電泳）、軟件和經驗的研究所中心實驗室和專業服務公司來完成STR分型。 文獻中，通常建議研究人員在培養細胞的較早階段（細胞培養第一周）來鑒定細胞系的身份。細胞在被凍存前應再一次進行鑒定；對于活躍生長的細胞，每兩個月應鑒定一次；文獻發表前也應對細胞系身份進行鑒定。如果一個實驗室使用不止一種細胞系，則應在實驗最開始時，就要對所有的細胞系進行鑒定，以便排除交叉污染(8)。

總結

  由于細胞培養體系在生物藥物的研究和技術發展中非常重要，適當的細胞系鑒定過程即成為每個研究人員的最大興趣點。然而，交叉污染的問題仍然存在。隨著世界范圍內實驗室使用新細胞系的數量增多和頻率增加，在質量控制（如：細胞系鑒定）的基本原則上產生了巨大的差別。從已經發表的、使用“錯誤”的細胞系而導致可疑性結果的研究論文，到用于臨床的干細胞系和其它細胞系，交叉污染影響到了科學研究的每個領域—從實驗臺到臨床。如果在細胞培養的處理和操作中不進行重大變革，那么交叉污染將會成為一個更大、更嚴重的問題。

參考文獻
1. Drexler, H.G., Dirks, W.G. and MacLeod, R.A.F. (1999) Leukemia 13, 1601–7.
2. Drexler, H. G. et al. (2001) Blood 98, 3495–6.
3. Cabrera, C.M. et al. (2006) Cytotechnology 51, 45–50.
4. Chatterjee, R. (2007) Science 315, 928–31.
5. MacLeod, R.A.F. et al. (1999) Int. J. Cancer 83, 555–63.
6. Buehring, G.C., Eby, E.A. and Eby, M.J. (2004) In Vitro Cell. Dev. Biol. 40, 211–5.
7. Liscovitch, M. and Ravid, D. (2007) Cancer Lett. 245, 350–2.
8. FDA. General Requirements for Laboratory Controls. 21 CFR
211.160 and 21 CFR 610.18.
9. ATCC Connection Newsletter (2007) 27, 2–4.
10. ATCC Connection Newsletter (2000) 21, 1–2.
11. Masters, J.R. et al. (2001) Proc. Natl. Acad .Sci. USA 98, 8012–7.

操作手冊
Cell ID™ System Technical Manual #TM074 (www.promega.com/tbs/tm074/tm074.html )

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