流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是一種對液流中排成單列的細胞或其它生物微粒（如微球，細菌，小型模式生物等）逐個進行快速定量分析和分選的技術。作為應用流式細胞術進行檢測的技術平臺，現代流式細胞儀產生于上世紀六七十年代。經過近四十年的發展和完善，今天的流式細胞儀已經十分成熟，并被廣泛的運用于從基礎研究到臨床實踐的各個方面，涵蓋了細胞生物學、免疫學、血液學、腫瘤學、藥理學、遺傳學及臨床檢驗等領域，在各學科中發揮著重要的作用。

現代流式細胞術綜合了流體力學技術、激光技術、電子物理技術、光電測量技術、計算機技術、熒光化學技術及單克隆抗體技術，是多學科多領域技術進步的結晶。隨著現代科技的高速發展，為了滿足生命科學對細胞分析更高層次的要求，流式細胞技術仍然在快速發展，并已經在檢測技術、分選技術及高通量分析等方面取得了許多突破。本文就流式細胞術的*新進展做一些介紹。

一、流式細胞檢測與細胞成像的結合

使用傳統的流式細胞檢測技術，研究人員可以分析成千上萬個細胞，獲得每個細胞的散射光信號和熒光信號的數值，從而得到細胞群體的各種統計數據，并可以找到稀有的細胞亞群。但是傳統流式細胞檢測技術仍然存在局限，那就是獲得的細胞信息很有限。細胞對研究人員來說，只是散點圖上的一個點，而不是真實的細胞圖像，缺乏細胞形態學、細胞結構及亞細胞水平信號分布的相關信息。要想獲得細胞圖像，研究人員就必須使用顯微鏡進行觀察，但顯微鏡能夠觀察的細胞數量是非常有限的，很難提供細胞群體的量化與統計數據。因此，使用傳統的細胞分析技術，我們就只能面對這樣的兩難選擇，沒有一種技術可以既提供細胞群體的統計數據，又獲得細胞圖像。不過，*近美國Amnis公司推出的ImageStream成像流式細胞儀，給傳統細胞分析帶來突破性的變革。

ImageStream是一種臺式多譜段成像流式細胞儀（Multispectral Imaging Flow Cytometry），能夠同時采集6個檢測通道中的細胞圖像（圖1）。它將流式細胞檢測與熒光顯微成像結合于一身，既能提供細胞群的統計數據，又可以獲得單個細胞的圖像，從而提供細胞形態學、細胞結構和亞細胞信號分布的信息。

圖1. ImageStream流式細胞成像系統

與傳統流式細胞儀很類似，ImageStream也是由液流系統，光學系統和電子系統等三大部分組成。液流系統將樣本細胞懸液和系統鞘液注入流動室中，使細胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個流過檢測窗口。光學系統中光源照射通過檢測窗口的細胞，從而產生光信號。光源分為兩種，其一是用于產生明場細胞圖像的鹵燈（Brightfield Illuminator），另一種是用于產生熒光細胞圖像的激光器。光源照射細胞產生的光信號被具有很大數值孔徑（NA：0.75）的物鏡收集，然后通過光路系統傳遞到由二向色鏡構成的濾光片堆棧（Dichroic Filter Stack），光信號在這里被分成不同波段投射到一個六通道冷CCD上，產生一個明場細胞圖像，一個暗場細胞圖像（Side Scatter，SSC）及四個不同熒光通道的細胞圖像。ImageStream的光路系統能夠自動調整焦距，并實時測定細胞運動速度，而其冷CCD采用時間延遲積分方式（Time Delay Integration，TDI）進行信號采集，上述這些手段保證了系統采集到的細胞圖像的質量。

ImageStream系統配有功能強大的數據分析軟件IDEAS（圖2），可以對每個細胞分析超過500種量化參數。這些參數不僅包括細胞整體的散射光和熒光信號強度，還包括對細胞形態，細胞結構及亞細胞信號分布的分析。通過在細胞群體中對這些參數進行統計，分析軟件可以生成細胞群體的散點圖和柱狀圖，而這些統計數據與細胞圖像是完全整合的，比如點擊散點圖上的點，就可以直觀的看到這個點代表的細胞的圖像。另外，使用者還能夠根據自身研究的特殊需要，進行自定義參數的設定，進行更深入的分析。

圖2. IDEAS分析軟件

ImageStream流式細胞成像系統結合了流式細胞檢測功能與熒光顯微成像功能，并整合了功能強大的分析軟件，幾乎可應用于細胞分析的所有領域，大大深化和拓展了流式細胞術的應用。下面簡要列舉一些ImageStream的新穎應用。

1. 細胞信號轉導/通路分析 (Cell Signaling/ Pathway Analysis）
細胞信號通路中關鍵因子的磷酸化水平和在細胞內的分布是細胞信號轉導研究的重要內容。ImageStream系統結合流式細胞術與熒光顯微成像的檢測方式，一方面可以統計細胞內因子的磷酸化程度，一方面可以通過分析細胞圖像來確定信號因子在亞細胞水平定位的變化，因而非常適合進行這方面的研究。

轉錄因子從細胞質轉移到細胞核（Nuclear Translocation）是細胞信號轉導的重要事件。傳統的檢測方法是使用熒光顯微鏡進行觀察，但是這種方法效率很低，所能觀察的細胞數量十分有限，且很難對不同細胞的轉位程度進行評估。為了更有效的檢測Nuclear Translocation，ImageStream系統在IDEAS分析軟件中引入了一個全新的參數—Similarity，來對采集的細胞圖像進行分析。所謂Similarity，是指兩個不同熒光檢測通道采集的熒光圖像在空間分布上的一致性（圖3）。Similarity值越高，則兩張細胞圖像上的信號分布越相似。對于Nuclear Translocation研究來說，Similarity值越高，細胞因子轉位的程度就越高。

NF-κB是一類重要的轉錄因子，能夠在多種組織中激活不同基因的表達，與慢性和急性炎癥，自身免疫性疾病及多種癌癥的發生存在著聯系。脂多糖（LPS）能夠激活人類單核細胞系THP-1的一個信號通路，導致NF-κB的轉位。研究人員使用LPS處理細胞，Alexa Fluor 488標記的抗NF-κB抗體和7-AAD染色細胞，利用ImageStream進行檢測。在散點圖上以一定的Siminlarity值設門，定量分析NF-κB轉位的細胞亞群所占比例，然后通過觀察細胞圖像，確認結果的準確性。分析顯示，LPS處理后，細胞內的NF-κB發生了明顯的轉位，細胞群體的Median Similarity值由-1.358變為2.114，發生高度轉位的細胞比例從0.72%增加到45.9％（圖4）。

T-bet是屬于T-box家族的新型轉錄因子,選擇性地表達于Th1細胞。研究人員利用ImageStream系統研究了這種T細胞特異性轉錄因子的轉位情況。從T-bet敲除小鼠的脾臟和淋巴結中分離的CD4陽性細胞被轉染了帶有T-bet基因和GFP報告基因的質粒。T-bet位于激素誘導啟動子（Estrogen receptor promoter, ER）的下游。實驗采用他莫昔芬（Tamoxifen）處理細胞，觀察T-bet轉位的情況。T-bet用Cy3標記，細胞核用DRAQ5染色，在柱狀圖上設R4門，通過觀察門內和門外的細胞圖像，確定設門位置為Similarity值大于1.8。結果顯示，他莫昔芬處理后，細胞中的T-bet轉核程度有了顯著的增加，發生T-bet轉核的細胞百分比從22.7增加到57.9（圖5）。

細胞因子可以誘導CD4陽性細胞內相關信號通路的激活，導致STAT4（signal transducer and activator of transcription 4）的磷酸化和向細胞核內轉移。研究人員用IL-12處理人外周血單核細胞（PBMC），然后用抗pSTAT4和CD4的抗體及DRAQ5染色，利用ImageStream檢測pSTAT4的轉位。結果表明，IL-12處理半小時后，pSTAT4發生了明顯的向細胞核內的轉移（圖6）。

2. 細胞間相互作用（Analysis of Cell Conjugates）
細胞間的相互作用是通過細胞膜相互接觸部位上的分子相互作用來實現的。研究細胞間相互作用，不僅要找到細胞雙聯體，還要對兩個細胞接觸部位的信號分子的分布進行研究。T細胞與抗原遞呈細胞（APC）之間的相互作用，作為T細胞活化過程的重要部分，是研究細胞間相互作用的一個很好范例。

在這個實驗中，研究人員使用一種D011.10 TCR轉基因小鼠淋巴結中分離的OVA多肽特異性T細胞與OVA多肽致敏APC進行研究。實驗的第一步是尋找兩種細胞的雙聯體。首先利用針對T細胞特異性標記Thy1.1和T細胞受體（TCR）信號通路關鍵因子ADAP（Adhesion and Degranulation promoting Adaptor Protein）的抗體和細胞核染料7-AAD染色細胞。然后利用ImageStream檢測樣品。在散點圖上設門，找到Thy1.1和ADAP雙陽性的T細胞，然后在這些細胞中尋找細胞雙聯體。IDEAS分析軟件提供了Aspect Ratio參數，即細胞橫縱軸長度之比，來區分不同形態的細胞（圖7. A）。散點圖中具有更高的7-AAD信號和較小Aspect Ratio值的群體就是細胞雙聯體（圖7. B）。

由于是在T細胞群基礎上尋找細胞雙聯體，所以得到的雙聯體中不僅有T細胞和APC的雙聯體，也有兩個T細胞組成的雙聯體，因此還需要做進一步分析。利用IDEAS分析軟件提供的Delta Centroid參數，即兩個熒光圖像中心之間的距離，可以方便的區分上述兩種雙聯體（圖8. A）。如果雙聯體上都是T細胞，兩者都表達ADAP分子，那么ADAP信號的中心與細胞核信號中心之間的距離就很近；如果雙聯體由T細胞和APC構成，其中只有T細胞表達ADAP，因此ADAP信號的中心與細胞核信號中心之間的距離就比較遠。圖8. B中編號為7058的雙聯體就是兩個T細胞組成的，ADAP和7-AAD代表的細胞核之間的Delta Centroid只有2個象素，而編號5527的雙聯體由T細胞和APC組成，ADAP和細胞核之間的Delta Centroid達到7.1個象素。

這樣，研究人員就可以在散點圖上設門，通過觀察細胞圖像來確認設門的準確性。圖中右上方的細胞群，也就是ADAP和細胞核之間的Delta Centroid值和ADAP的Aspect Ratio值都較大的細胞群就是T細胞和APC結合的雙聯體，占總細胞群體的19.1％（圖9）。T細胞與APC之間要產生相互作用，除了需要形成細胞雙聯體，還要有信號分子在細胞結合部位富集，以形成免疫突觸（Immune Synapse）。通過軟件分析兩個細胞結合部位的ADAP信號占整個細胞ADAP信號的比例，以及ADAP的Aspect Ratio值，研究人員找到了已經形成免疫突觸的T細胞與APC雙聯體，其比例約占整個細胞群體的17.6％（圖10）。

3 . 分子共定位與胞內分子轉運（Analysis of Molecular Colocalization and Intracellular Molecular Trafficking）
治療性抗體在細胞內的作用位點是分子共定位研究的一個重要方面。研究人員利用ImageStream研究了一種抗腫瘤治療型單抗“利妥昔”（Rituximab，RTX）的作用機制。前人的研究表明，RTX能與CD20特異性結合，其抗腫瘤活性與補體依賴型細胞毒性（Complement-dependent cytotoxicity，CDC）有關。

本實驗中，從慢性淋巴細胞性白血病病人血液中分離的B細胞與AF488標記的RTX孵育，然后分別被PE標記的抗補體C3b的抗體（7C12）和作為陰性對照的抗CD45的抗體染色。經ImageStream的檢測，通過Similarity參數進行分析，結果顯示，RTX與CD45沒有分布上的一致性（圖11.A），而與C3b具有明顯的共定位特征（圖11.B），表明RTX與CD20陽性細胞的結合可能激活了補體信號通路，并導致C3b補體在RTX結合處富集，從而形成共定位。

人血液樹枝狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC)是免疫系統病毒響應的重要部分。雖然它只占外周血細胞的0.2％不到，但卻在HSV響應中發揮重要作用。相關研究人員利用ImageStream對病毒響應過程中pDC細胞對病毒碎片的內攝（Internalization）和胞內轉運進行了研究。本實驗中，將從人外周血中分離的pDC細胞與CpGB分別在4℃和37℃進行孵育，然后使用PE標記的抗pDC細胞標記BDCA的抗體和FITC標記抗內涵體標記CD71或抗溶酶體標記CD107a的抗體對細胞進行染色，*后用ImageStream進行檢測。利用散點圖上設門找到BDCA陽性的pDC細胞群，然后分析CpGB的Internalization參數，及其與CD71和CD107a的Similarity參數，生成散點圖。所謂CpGB的Internalization參數，指細胞內部CpGB的信號占總的CpGB信號的比例。結果顯示，4℃孵育會抑制CpGB的內攝。37℃孵育0.5小時后，在24.6％的pDC細胞中，CpGB定位于內涵體；37℃孵育2小時后，在18.8％的pDC細胞中，CpGB定位于內涵體（圖12. A）。37℃孵育0.5小時后，在26.9％的pDC細胞中，CpGB定位于溶酶體；37℃孵育2小時后，在66.8％的pDC細胞中，CpGB定位于溶酶體（圖12.B）。這說明CpGB被pDC細胞內攝后，首先進入內涵體，然后被轉運到溶酶體中。

4. 細胞形態學（Quantitative Morphology）
細胞形態的改變是免疫響應的一個方面。當病原體侵入機體后，首先被入侵的細胞會釋放出一些化學信號，誘導免疫細胞發生形變，并向病原體入侵的部位移動。一些研究人員研究了化學誘導物MCP-1引發的細胞變形。該實驗采用FITC標記的抗CD14抗體染色細胞，然后用ImageStream檢測。利用Circularity參數對CD14陽性細胞群體進行分析。所謂Circularity參數，是指細胞平均半徑比上細胞半徑的變量。結果顯示，MCP-1處理后，變形的細胞從9.5％增加到60.9％（圖13.）。

偽足形成實驗也是細胞形態研究的一個領域。相關研究人員對一個IL-3依賴性細胞系在IL-3饑餓3小時后重新供給IL-3，觀察細胞偽足形成的情況。細胞被PE標記的抗偽足標記分子Podo的抗體和DRAQ5染色，然后用ImageStream進行檢測。利用上述的Aspect Ratio和Delta Centroid參數繪制散點圖，將偽足形成過程中的細胞分成Uniform、Capped及Pseudopod等三類（圖14.A）。結果顯示，隨著IL-3孵育時間的延長，Uniform細胞逐漸減少，而形成偽足的細胞逐漸增加（圖14.B）。

5. 熒光原位雜交（FISH In Suspension）
通過使用ImageStream，高通量FISH可以應用到懸浮細胞中。相關研究人員利用12號染色體的一個探針與人外周血單核細胞進行雜交，利用IDEAS軟件進行自動數點分析，結果顯示了該位點在遺傳上非常穩定（圖15.）。

6. 基因表達分析（Gene Expression Analysis）
綠色熒光蛋白（GFP）是用于基因表達分析的常用標記。錐形蟲（Trypanosome）是一種與多種人類疾病相關的單細胞病原體。相關研究人員利用GFP研究了兩種基因P19和NP19在錐形蟲體內的表達情況。該實驗中，錐形蟲分別被P19-GFP和NP19-GFP轉染，然后用DRAQ5染色，在ImageStream上進行檢測，其中GFP在通道3（Ch3）檢測，DRAQ5在通道6（Ch6）檢測。分析時，首先在散點圖上找到GFP陽性的細胞群，然后利用Similarity參數分析GFP信號分布與細胞核的相似度，結果顯示，轉染NP19-GFP的細胞，平均的Similarity值達到2.1366，在84.5％的細胞中GFP信號定位于細胞核（圖16. B），而轉染P19-GFP的細胞，這兩項數值分別為0.843和14.7％（圖16. A）。這個結果表明，P19蛋白定位于細胞質，而NP19定位于細胞核。

7. 細胞凋亡（Apoptosis Analysis）
細胞凋亡是一種細胞程序性死亡的組織生理過程，表現為細胞膜外翻、細胞質起泡及染色體的斷裂和濃縮，主要發生在細胞分化(如胚胎發生)，自體調節，細胞損傷響應(如病毒感染，DNA損傷)等重要生理過程，是細胞生物學的重要研究領域。目前，利用流式細胞術可以檢測的細胞凋亡標志主要有Annexin V，TUNEL，Caspase等。ImageStream可以檢測所有這些凋亡標記，而與傳統流式檢測相比，其具有兩方面獨特的優勢：一是能夠區分假陽性和假陰性，二是能準確區分凋亡和壞死。

細胞凋亡檢測過程中，常常會遇到假陽性和假陰性的情況。假陽性一般是由于正常細胞上黏附了凋亡小體，從而在流式檢測時誤認為是陽性。如圖十七所示的情況，一些正常細胞表面附著了TUNEL陽性碎片，從而顯示TUNEL陽性。對于這種情況，可以利用IDEAS軟件中的Delta Centroid參數來區分真假陽性（圖17. ）。

類似的情況也同樣出現在Annexin V和Caspase檢測中，凋亡小體會附著在正常細胞表明，造成假陽性，而一些已經出現了染色體斷裂和濃縮的凋亡細胞卻是Annexin V或Caspase陰性的，從而造成假陰性結果。由于ImageStream能夠獲得細胞圖像，并對圖像進行分析，因此可以排除這些假陽性和假陰性結果。

大多數的利用流式細胞術檢測凋亡的方法，比如Annexin V法，都很難區分晚期凋亡和壞死細胞，因為這兩類細胞都表現為凋亡標記和細胞核染料的雙陽性。但這兩種細胞在細胞核形態上存在明顯區別：晚期凋亡細胞由于染色體的斷裂和濃縮，細胞核不完整，而是塌縮為幾個小的區域，相反壞死細胞的細胞核很完整。根據這個特征，ImageStream可以通過對細胞核形態進行分析，清晰的區分細胞凋亡的不同階段，區分晚期凋亡和壞死細胞（圖18）。

8. 細胞周期分析（Cell Cycle Analysis）
使用細胞核染料進行細胞染色，然后利用流式細胞儀檢測，這是細胞周期分析的常用方法，但這種方法不能區分有絲分裂的不同階段。傳統的有絲分裂細胞分析方法是顯微鏡下觀察，但有絲分裂細胞數量很少，肉眼進行觀察和統計，效率低下且很難保證準確性。ImageStream可以將細胞周期分析和有絲分裂細胞分析結合起來。如圖19所示，研究人員利用ImageStream對40000個HL60細胞進行細胞周期檢測，然后進一步在其中找到了392個處于有絲分裂狀態的細胞，并將這些細胞區分為有絲分裂前期、中期、后期及末期等不同階段。

9. 白細胞亞群分析（Cell Classification）
白細胞亞群分析是流式細胞術*常見的應用之一，利用ImageStream進行細胞分群，不僅可以獲得每個亞群的統計數據，還能直觀的看到細胞圖像（圖20）。

二、分選微型模式生物

微型模式動物、模式植物種子、大體積細胞及微球的分選在生命科學研究中有著非常廣泛的應用，但是由于這些對象體積太大，普通流式細胞儀難以對其進行分選，而手工鏡下分選耗時耗力，效率底下，準確性難以保證，因此美國Union Biometrica公司的COPAS生物分選系統應運而生。COPAS系統是目前市面上唯一的能夠分選20-1500μm生物微粒的全自動、高通量分選系統，可以檢測微粒的尺寸、光密度及熒光信號，并根據用戶設定的域值，將相應的微粒噴入96孔板或其它容器中，整個過程對于微粒的生物活性不會產生任何負面影響。

COPAS技術平臺是基于流式細胞技術開發的，但它與普通流式細胞技術相比，做了兩個重要的改進以適應大體積生物微粒分析與分選的需要。

第一，系統管路直徑增大以適應20-1500μm大小的生物微粒，這比普通流式細胞儀用于分選單個真核細胞的管路大的多。每一個COPAS系統都針對不同尺寸范圍的微粒進行管路的優化設計，以便在高速高通量分選時獲得*好的檢測靈敏度與準確性。

第二，專利的氣流分選裝置—COPAS技術的核心，那就是（圖21）。當不需要收集分選微粒時，分選系統會通過氣體將液流吹入廢液槽中；當需要分選的微粒經過時，分選系統會暫時將氣體分流器關閉，使氣流中斷，然后再重新打開分流器，這樣就能將含有待選微粒的液流噴入微孔板或收集容器中。這種分選的方式非常溫和，可以保證收集到的生物活體或敏感化學物質的活性和完整性，對于后續的培養和分析不會產生任何負面影響，而普通流式細胞儀一般采用電磁場進行分選，會對生物活體產生致命的影響。

COPAS生物分選系統被廣泛應用在模式動植物研究、大體積細胞研究及藥物篩選等方面，具體應用對像包括微型模式動物：C. elegans、D. melanogaster、Zebrafish、Medaka、Mosquito、Xenopus；模式植物種子與花粉：Arabidopsis、花粉；大體積細胞與細胞簇：胚胎干細胞、胰島；微球/顆粒：化合物結合微球、微球分析。僅僅統計COPAS在線蟲分選方面的應用，就在Nature系列雜志上發表了7篇以上的文獻。COPAS系統可以根據死活、不同生長時期及熒光信號強弱來分選線蟲，下面是COPAS分選線蟲的兩個簡單實例。

1) 根據線蟲大小(TOF)和光密度(EXT)兩個參數，對不同生長時期的線蟲進行分選和分析
2）利用熒光信號（FLU）參數，分選轉基因線蟲

三 、高通量分析
隨著生命科學領域的研究者對于自動化檢測和高通量篩查提出了越來越高的要求，能夠自動進行高通量檢測的流式細胞系統也應運而生。專業流式細胞儀生產廠家BD開發的FACSArray 生物分析儀就是一個典型的例子。FACSArray系統外形簡潔，操作簡便，其光學系統配置了532nm綠色激光器和635nm紅色激光器，可以檢測2個散色光信號和4個熒光參數。由于整合了96孔板上樣技術和數字化電子系統，使得樣本采集的速度達到15000個/秒，尤其適用于高通量篩選。FACSArray 生物分析儀不僅可以應用于傳統的流式細胞分析領域，而且還可以和BD公司開發的CBA技術（Cytometric BeadArray）結合，用于多重蛋白檢測，為高通量流式分析創造了一個新的標準平臺。

綜上所述，隨著現代科技的發展，流式細胞技術已經在檢測技術、分選技術及高通量分析方面取得了重大突破，將會為生命科學領域的進步作出更大的貢獻。