簡介
哺乳動物跨膜蛋白承擔各種生物功能，在疾病的發生、發展過程中扮演重要角色。已知的許多針對人類疾病研發的藥物的靶標是膜蛋白或膜關聯蛋白（綜述：Landry 2007），而成功的藥物設計很大程度上依賴于人們對膜蛋白的結構與功能數據的正確把握。膜蛋白的蛋白質組學分析是被大家看好的辨識新的藥物靶標和/或疾病的生物學標記的好方法，并已得到廣泛應用。然而，多年的蛋白質組學研究支撐技術的顯著進步，也沒能解決膜蛋白的抽提和增溶困難的問題。同時，膜蛋白樣品的制備并不是孤立的，還需要充分考慮到與下游的膠分析及質譜分析等應用配套，這使膜蛋白樣本制備成為一個難以逾越的挑戰。雖然膜蛋白研究的重要性眾所周知，到目前為止有效的樣本制備技術方法仍然非常缺乏，極大地限制了膜蛋白蛋白質組學的進展。

跨膜蛋白通過許多疏水氨基酸殘基錨定在膜結構里面，很難溶解在水性緩沖液系統中。為了制備膜蛋白樣品，傳統的方法是使用去污劑和表面活性劑增溶。去污劑處理會使膜蛋白喪失其天然結構，因而妨礙了膜蛋白的功能研究。

根據其明顯的疏水性特點，人們常用“去污劑＋機械處理”的操作方法獲取膜蛋白，用于增溶的去污劑有離子型（如SDS）和非離子型的（如Triton®-X）等。SDS會使多數蛋白完全變性，限制了很多下游分析。非離子型的去污劑較為溫和，但抽提膜蛋白（特別是有多個跨膜區的膜蛋白）的效果往往很差。發展一種有效的膜蛋白抽提方法，使其既能保持膜蛋白的天然結構（或至少是活性結構），又有較高的產量和純度等優點，已經成為研究者們的急切要求。

Novagen新近研發上市的ProteoExtract 跨膜蛋白抽提試劑盒（簡稱TM-PEK）是一種基于化學而非去污劑方法的高產膜蛋白制備試劑盒（操作參見圖1）。其簡便的兩步法操作可以高效地富集膜蛋白和膜關聯蛋白。試劑盒包括兩種試劑，TM-PEK試劑A和TM-PEK試劑B，分別用于制備抽提緩沖液2A和抽提緩沖液2B。使用者通過實驗摸索，可以根據特定目的蛋白的特點從中靈活選擇最適緩沖液。用ProteoExtract TM-PEK試劑抽提得到的蛋白適合用于常見的各種蛋白分析方法。從以下的報告中，列舉了TM-PEK制備的跨膜蛋白和多次跨膜蛋白樣品在免疫印跡、活性分析及2D電泳等方面的實例。

圖1 TM-PEK的操作流程

帶7個跨膜區的蛋白的抽提結果與討論
為了驗證ProteoExtract跨膜蛋白抽提試劑盒抽提多次跨膜蛋白的有效性，我們用免疫印跡比較了Frizzled-4，CELSR-3（cadherin-EGF-lag seven-pass receptor-3）和EGFR（表皮生長因子，只有一個跨膜區）的樣本制備效果。Frizzled和CELSR是WNT/ PCP （平面細胞極性）通路的重要組成成分，而這個重要的通路則控制了組織的極性和細胞的遷移。Frizzled蛋白與GPCRs有遠源關系，但是除開都具有7個跨膜區的結構外，它們的結構和功能存在很大差異（參見Huang 2004）。血漿膜定位Frizzled蛋白是Wnt分泌蛋白和其它多種配基的受體（參見Huang 2004，Planutis 2007）。在人體內，Frizzled-4與家族性滲出性玻璃體視網膜病變（familial exudative vitreoretinopathy）有關，這個疾病導致視網膜破壞及聽力持續下降。CELSR-3和CELSR-2的功能是控制神經元接觸位點的相互作用和神經突觸的生長。CELSR-3抑制生長，而CELSR-2促進生長（參見Shima 2007）。關于CELSR-3的數據很有限，反映出要制備完整的CELSR-3非常困難。Western blot分析（圖2）比較了Triton-X 100和新發明的TM-PEK試劑A的抽提效果，SDS抽提的作為目的蛋白大小的陽性對照。結果表明，對于僅具單跨膜區的EGFR，Triton- X 100和TM-PEK試劑A的抽提效率相同。Triton-X-100抽提Frizzled-4效果很差，相反，TM-PEK試劑A得到的Frizzled-4在western blot中獲得了明顯的信號（圖2B）。而TM-PEK試劑對CELSR-3的抽提效果非常令人驚喜，這種全長的358kD蛋白只有TM-PEK試劑A才能獲得，而SDS或Triton X-100效果都使人失望（圖2）。

圖2 培養MDA-MB-468乳腺癌細胞的跨膜蛋白抽提
按照Novagen操作手冊TB477，以TM-PEK跨膜蛋白抽提試劑盒抽提MDA-MB 468細胞跨膜蛋白。第一步，兩份1×107 個細胞用TM-PEK 1處理，獲得細胞質可溶蛋白。不溶部分再用TM-PEK抽提緩沖液2A（即TM-PEK 2A）或0.5% Triton X-100處理。樣品的1/10體積（相當于1×106個細胞獲得的抽提物）跑10% SDS-PAGE膠，再轉到硝酸纖維素膜。膜封閉，并以EGFR一抗孵育（A板），Frizzled-4 （B板）或CELSR-3（C板）。用HRP標記二抗和化學發光底物顯色。第1道0.5% SDS 抽提（總細胞抽提物）；第2道可溶組分（TM-PEK 1）；第3道膜組分（Triton X-100）；第4道膜組分（TM-PEK 2A）。箭頭顯示全長蛋白的遷移。 SDS抽提（總細胞裂解物）作為陽性對照。

活性膜蛋白的抽提
圖3顯示內源的糖基化磷脂酰肌醇錨定蛋白堿性磷酸酶的活性通過以p-硝基苯基磷酸鹽為底物的方法測定，TM-PEK試劑B抽提的蛋白活性較Triton X-100的高70%。

圖3 Triton X-100，TM-PEK試劑B和SDS抽提的膜組分的堿性磷酸酶活性檢測結果比較
以p-硝基苯基磷酸鹽為底物，在A405測每分鐘代謝率。反應緩沖液為0.1M氨基乙酸，1mM MgCl2，1mM ZnCl2，pH10.4。數據根據Triton X-100的效果做標準化處理，做了4個獨立的重復實驗。

膜蛋白質組的抽提效果
發現受體介導的信號通路中新的生物學標記的第一步是抽提膜蛋白。然而，無論是樣本制備還是膜蛋白分離還都困難重重。目前最為主流的方法是2D電泳分離蛋白加質譜分析。可惜，傳統的2D電泳對膜蛋白非常不適用，疏水的膜蛋白在等電聚焦時常常會發生積聚（參見Braun 2007）。同時，膜蛋白也難以從疏水固定的pH梯度膠進入第二向的SDS膠（參見Braun 2007）。正如圖4的數據所顯示的，用ProteoExtract跨膜蛋白抽提試劑盒從A431細胞制備的蛋白進行2DGE分離時獲得了與Triton X-100處理不同的結果，而且TM-PEK得到的蛋白組的代表性也明顯較好（圖中膠的右側）。

圖4 A431細胞Triton X-100抽提（洋紅色）和TM-PEK試劑B抽提（綠色）效果比較
2D電泳每種樣品上樣量為200μg。黑色為重疊的同種蛋白。第一向為IEF，pH 3-10（左至右）；第二向是4-15% Tris-HCl SDS-PAGE。

結論
以上數據表明ProteoExtract跨膜蛋白抽提試劑盒能夠非常有效地抽提膜蛋白。其溫和的非去污劑設計使抽提產物適用于各種蛋白質組研究方法，包括酶活分析（如激酶活性檢測），非變性膠電泳，1D和2D SDS-PAGE，western blot以及ELISA等。1D或2DGE后，樣品經胰酶消化可以做MS分析。此外，可以按起始材料按比例放大或減少試劑用量，以及可優化選擇試劑配方的抽提操作，又進一步提高了這個試劑盒獲取完整膜蛋白和生物條件下的膜關聯蛋白的效果。ProteoExtract跨膜蛋白抽提試劑盒重現性極好，易與下游實驗配套。與其它方法不同，這個方法不需要超聲，長時間高強度渦旋，超速離心和高溫孵育等破壞蛋白的處理，從而使蛋白的降解和次級修飾的風險降到最低。

產品信息
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit    貨號71772-3  (詳細情況請參考www.merckbio.com)

參考文獻
Braun, R. J., et al. 2007. Anal. Bioanal. Chem. 389, 1033.
Huang, H-C., and Klein, P. S. 2004. Genome Biol. 5, 234.
Landry, Y., and Gies, J.P. 2007. Fund. Clin. Pharm. 22, 1.
Planutis, K., et al. 2007. BMC Cell Biol. 8, 12.
Shima, Y., et al. 2007. Nature Neurosci. 10, 963.