細胞分選的原理
當經(jīng)熒光染色或標記的單細胞懸液放入樣品管中，被高壓壓入流動室內(nèi)。流動室內(nèi)充滿鞘液，在鞘液的包裹和推動下，細胞被排成單列，以一定速度從流動室噴口噴出。在流動室的噴口上配有一個超高頻的壓電晶體，充電后振動，使噴出的液流斷裂為均勻的液滴，待測細胞就分散在這些液滴之中。將這些液滴充以正、負不同的電荷，當液滴流經(jīng)過帶有幾千伏的偏轉(zhuǎn)板時，在高壓電場的作用下偏轉(zhuǎn)，落入各自的收集容器中，沒有充電的液滴落入中間的廢液容器，從而實現(xiàn)細胞的分離。

流式細胞分選的特點
1. 少量細胞分選時，流式細胞分選精確度高（99%以上），速度快。目前，先進的流式細胞儀的分選速度可達25 000個細胞/秒以上，比傳統(tǒng)的分選速度提高了很多倍，原來需要一天的工作現(xiàn)在只需要幾小時就能完成。不過流式細胞儀分離細胞的量還是有一定的限制，一次分離的最大合理量約為10⁸個細胞。如果細胞量超過10⁹個，則需要耗費10小時以上，分選后細胞的活力會受到很大的影響。

2. 可以同時進行多個Marker分選，正選負選同時進行。以前的流式細胞儀只能給液滴充上正電荷或負電荷，因此在電場中只能向左或向右偏轉(zhuǎn)，即兩路分選。現(xiàn)在的儀器可以給液滴充以不同的電量，從而調(diào)整液滴的偏轉(zhuǎn)角度，實現(xiàn)多路分選。BD的FACSAria流式細胞儀就可以進行四路分選。

3. 不僅僅限于表面抗原，流式細胞儀可以根據(jù)任何能檢測到的發(fā)光度（如細胞體積）或熒光（如DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特異抗原）散射度差異來分離細胞。如果能保證流式細胞儀的無菌狀態(tài)，那么分選后的細胞還可以進行培養(yǎng)或其他分析。

4. 如果只是偶爾做幾次細胞分選的話，用流式分選還是比較劃算的，只需要準備樣品和抗體，交納一定的儀器使用費即可，不需要購買配套的設備。

流式細胞儀
由于價格的原因，大家對流式細胞儀一直是心有余而力不足，但現(xiàn)在它也開始進入一些大型實驗室了。市場上銷售的流式細胞儀產(chǎn)品種類很多，主要生產(chǎn)廠家有：BD、Beckman Coulter、Partec、Accuri Cytometers、Guava、Union Biometrica、Amnis等，大家比較熟悉的還是BD和Beckman Coulter。

BD公司一直致力于研究生產(chǎn)最先進的流式細胞儀。自從1974年與美國斯坦福大學合作研制出全球第一臺流式細胞分析儀以來，BD公司就不斷推陳出新，在流式細胞技術(shù)領(lǐng)域始終保持領(lǐng)先地位。BD公司的FACSAria流式細胞儀，更是世界上第一臺使用石英杯流動池固定光路標準，可以完成高速細胞分選的臺式流式細胞儀。它的高速細胞分選和多色分析的性能極佳，而操作卻非常簡單。

由于BD FACSAria流式細胞分選儀的出現(xiàn)，高速細胞分選的設置和操作變得極其簡單。BD FACSAria先進的儀器設計大大提高了分選性能，同時還增強了其它功能。在普通的空氣中液流受激光激發(fā)的流式細胞分選儀中，液流高頻振動常常會產(chǎn)生信號噪音，而BD FACSAria則完全消除了這一弊端。BD FACSAria產(chǎn)生液滴的高頻振動發(fā)生在石英杯流動池的底部噴嘴處，也就是在樣本與激光的正交點之后，這樣就不會干擾激光與樣本流的聚焦，因而不會產(chǎn)生干擾噪音。去除了這種噪音，檢測就更加準確和靈敏了。

BD FACSAria流式細胞儀的噴嘴與石英杯底部精確吻合，保證液流垂直進入下面的廢液吸引器。噴嘴位置是固定的，更換噴嘴后，液流仍然會保持在原來的正確位置上。噴嘴拆換簡便、精確。

BD FACSAria流式細胞儀可以使用70 μm或100 μm的噴嘴，滿足了絕大多數(shù)細胞分選的需要。噴嘴適合在各種不同的壓力和速度下進行細胞分選。兩路分選和四路分選是標準設計，分選時可以使用各種大小的細胞收集管（例如小管、12X75 mm管和15 mL管）。配件自動細胞定位分選裝置（ACDU）可以將定量細胞定位分選在微孔板或載玻片上。BD FACSAria流式細胞分選儀的性能非常靈活，為流式細胞分選提供了完整的解決方案。

與傳統(tǒng)細胞分選儀器相比，BD FACSAria流式細胞儀的集成設計減小了儀器體積，節(jié)省了整個使用空間。實際上，該儀器可以在任何空間里安裝工作，不需要其他輔助設備。儀器可以放在普通的實驗室平臺或桌子上，唯一需要的是一個標準電源插孔。這樣就更增加了它的親和力。

Beckman Coulter也提供了兩種強大的細胞分選系統(tǒng)。他們的CyAn ADP流式細胞儀使用3種激光，可實現(xiàn)9色分析。高速的電子和Summit軟件的使用可以有效處理1×10⁸個細胞的樣品，來分析那些稀有事件，如腫瘤干細胞研究。另一個MoFlo XDP流式細胞儀分析速度為100 000個細胞/s，分選速度為70 000個細胞/s，并且能在高產(chǎn)量的同時保留細胞的活力和功能。這臺儀器也具有四通道分選能力，并且分辨率極高，能夠讓研究者們更好的鑒定和分選他們感興趣的細胞群體。

細胞分選的新進展

1. 突破分選大小的限制。許多人利用流式細胞儀只要是分選普通培養(yǎng)的哺乳動物細胞，直徑一般不超過20微米。但隨著流式細胞儀的應用越來越廣泛，分選細胞的大小也不應成為限制。美國Union Biometrica公司就提供了市面上唯一的能夠分選20-1500 um生物顆粒的流式細胞儀COPAS系統(tǒng)。COPAS（Complex Object Parametric Analyzer & Sorter）可以分選線蟲，果蠅、水螅、蟾蜍、蚊子、斑馬魚的卵和幼蟲。COPAS技術(shù)的核心，是專利的氣流分選裝置。這種分選方式非常溫和，可以保證收集到的生物活體的活性和完整性，對于后續(xù)的培養(yǎng)和分析不會產(chǎn)生任何負面影響，而普通流式細胞儀一般采用電磁場進行分選，會對生物活體產(chǎn)生致命的影響。

以前這種類型的分選是在顯微鏡下用鑷子操作的，所以COPAS系統(tǒng)的出現(xiàn)對于科學家來說是個好消息。現(xiàn)在發(fā)育生物學家就能利用COPAS來分選幾千條幼蟲，來尋找概率很低的遺傳變異。你也可以利用它來篩選藥物化合物文庫。將藥物分布在微量滴定板中，每個孔中再放10條線蟲。孵育之后通過ReFLx附件將每個孔的東西逐個吸出，再送回流動室中重新分析。

2. 在分析的同時成像。普通的流式細胞術(shù)無法觀測細胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)，無法定位熒光信號到特定部位，但是現(xiàn)在這也不再是問題了。美國Amnis公司提供的ImageStream 100系統(tǒng)就很好地解決了這一問題。它將流式多色檢測技術(shù)和熒光顯微鏡圖像顯示技術(shù)集中在一個平臺上，提供了全新的細胞分析方法。ImageStream系統(tǒng)通過明視野、暗視野、熒光的組合，可以得到每個細胞的6張圖像。此外，他們還提供ImageStream光學系統(tǒng)的升級——EDF（extended depth of field）配件，可以增加圖像的質(zhì)量，確保整個細胞清晰。EDF使成像速率快了三倍，不僅提高了成像的質(zhì)量，還具有共聚焦顯微鏡的優(yōu)勢。這種能提供圖像的流式細胞儀在臨床上也有重要作用，可以用高通量熒光原位雜交來檢測血液中的腫瘤細胞，比現(xiàn)在的方法靈敏多了。

3. 流式的新幫手。以前，人們只是利用流式細胞儀來看細胞的免疫表型。現(xiàn)在，我們當然不滿足于這個，我們還想了解更多復雜的細胞過程，如細胞增殖、活力、凋亡和鈣流量。新的熒光染料、新的熒光探針、新的染色方法不斷推出，使得新的細胞參數(shù)的分析也日益增多。

應用活細胞進行分析是流式細胞術(shù)的一個趨勢。研究者們往往利用流式細胞儀收集某種細胞群體，然后將其回輸?shù)襟w內(nèi)，來觀察生理上的變化。Invitrogen就提供一種Vybrant DyeCycle染料，能在活細胞中進行細胞周期分析。這種染料毒性極小，分選出的細胞還能用于后續(xù)的研究，如干細胞鑒定或細胞治療。BD公司也提供了觀察不同細胞群體的工具。Phosflow細胞信號抗體可以讓研究者們在一個復雜的多樣群體中研究特異表型的細胞，并在單細胞水平上檢測多個蛋白的激活狀態(tài)。

附錄：BD流式試劑選擇及常見問題解答

一、如何搭配流式抗體熒光標記
流式抗體熒光標記搭配主要由3個因素決定的：流式細胞儀能檢測多少個通道、需要同時檢測檢測多少個指標、廠家的抗體有多少種熒光標記。如果流式細胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時做的表面/胞內(nèi)標志就越多

A、 如何根據(jù)流式細胞儀搭配流式抗體
1） BD流式細胞儀（06版目錄第614頁）
流式細胞儀能檢測多少個通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點：

流式細胞儀有哪些激光。比如標配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三個熒光通道/三個顏色，而選配的Calibur (FACSCalibur的簡稱)配有488nm和635nm兩根激光，可以檢測FL1-FL4四個通道/4個顏色。

不同型號的流式細胞儀的同樣的一個通道檢測熒光素的能力是不一樣的，比如Calibur的FL3（第3通道）能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能檢測PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能檢測的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道檢測。Calibur和LSR都能檢測4個顏色，但是第4個通道檢測熒光素是不一樣的

搭配熒光素原則
搭配流式熒光素有2個原則：每個通道只能選擇1種熒光素；各個通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意
1、每個通道只能選擇1種熒光素。以Calibur為例說明，Calibur的FL1通道選擇了FITC就不能選擇AlexaFluro488，或者選擇了Alexa Fluro488就不能選FITC Calibur的FL3通道盡管能檢測PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五個熒光素，但是我們我們搭配的時候只能選擇其中1個。

2、各個通道之間的熒光素可以隨意搭配：如果客戶的流式細胞儀能做4個通道，在第1個原則之下，那么每個通道隨便選出1個熒光素就可以組合成4個顏色。以2跟激光的Calibur為例，Calibur各個熒光素之間可以搭配出16種組合。

比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )＋P E（F L 2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 這個搭配組合可以更改成Alex Fluro(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)＋PE（FL2）＋PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。總之，在第1原則之下，我們可以隨意搭配和組合各個熒光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導致補償過度

B、 BD公司抗體有多少種熒光素
1） 供應商能提供的每種抗體的熒光素是不一樣的我們需要根據(jù)同時結(jié)合供應商能提供的每種抗體的熒光素進行搭配。原則上同一個標志的不同的克隆號帶同1個熒光素在應用上沒有區(qū)別的，但是有些不同克隆號的抗體之間可能會有一些稍微的差異，需要仔細看說明書。我們可以盡量選擇在說明書上有流式圖形的抗體，或者選擇熒光素種類最多的克隆號的抗體

2） 熒光素
可以登陸www.bdbiosciences.com/spetra，輸入熒光素和檢測的BD流式細胞儀機型及激發(fā)光，就可以查到相應的波長。
為什么要推薦使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？
因為這些熒光非常明亮，對激光非常穩(wěn)定，適合流式細胞儀的光譜性質(zhì)，對PH值不敏感，具有水溶性。此外，他們聯(lián)合使用時發(fā)射光譜存在巨大差異，無需補償。

C、如果檢測的指標數(shù)目超過了流式細胞儀的通道，怎么辦？
如果需要做5個指標，而流式細胞儀只能做4個通道，首先將指標歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

二、同型對照（Isotypy Control）
1、為什么要用同型對照？
同型對照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對照是真正意思上的陰性對照，它不但可以用來設定流式細胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細胞因子競爭封閉步驟。在流式細胞儀上樣前，染色方式如下：
  樣本管：一抗＋樣本
  同型對照管：同型對照＋樣本

2、如何選擇同型對照？
一般選擇與一抗的成分完全相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標記的抗體，比如抗人的CD56 APC標記的抗體，貨號是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是APC標記的Mouse IgG1,κ，貨號是555751。注意同型對照的成份跟它的名稱是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標記的二抗，那么應該選擇一抗的同型對照。比如CDw125的純化抗體，貨號是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對照是純化的Mouse IgG1,κ，貨號是555746。它的二抗PE標記的抗小鼠IgG1,貨號是550083。那么染色方式如下：
樣本管：純化的CDw25＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本
同型對照管：純化的同型對照＋PE標記的抗Mouse IgG1＋樣本

如果沒有找到適合的同型對照，在保持來源相同、熒光標記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應該是亞鏈不同－－亞型不同－－相同類別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對照表里面找到不到完全相同的同型對照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2а為同型對照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標記的Mouse IgG2b作為同型對照。如果最后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標記的Mouse IgG2作為同型對照。

3、如何查找同型對照？
同型對照在BD英文目錄中或者BD網(wǎng)站上跟它對照的抗體的位置是一致的。BD目錄中，抗人的抗體的同型對照都在HUMAN章節(jié)后面。抗小鼠的抗體的同型對照在MOUSE章節(jié)后面，非人類靈長類的抗體同型對照在NON HUMAN PRIMATE章節(jié)后面。由于抗大鼠的抗體非常少，大部分抗體都是小鼠來源的，所以它的同型對照跟小鼠的一樣，放在MOUSE章節(jié)后面。胞內(nèi)細胞因子、趨化因子、補體、炎癥介質(zhì)及其受體的同型對照放在其章節(jié)的后面（注意：人的胞內(nèi)細胞因子的同型對照跟人的表面標志的同型對照是不在一起的）。Phosflow的同型對照在Phosflow的介紹后面。比如，比如抗人的CD56 APC標記的抗體，貨號是555518，在06版BD目錄的169頁，成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對照應該是在HUMAN章節(jié)中Mouse Immunoglobulin Isotype表格中，第191頁，APC標記的Mouse IgG1,κ，貨號是555751。

4、哪些客戶需要使用同型對照？
A 對流式不是非常熟悉的客戶。
B 做胞內(nèi)流式客戶，比如胞內(nèi)細胞因子、趨化因子和信號蛋白等。
C 使用不常見的標志或者特異性不高的標志的客戶，因為客戶不熟悉不常見標志的表達情況，根據(jù)同型對照可以判斷陽性細胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對照可排除假陽性。
D 對流式非常熟悉又使用常用的表面標志的客戶一般可以不使用同型對照。

5、為什么有時候同型對照的表達會比抗體的表達高？
首先需要檢查同型對照的抗體是否加錯類型、劑量等。其次，因為有些標志在細胞的表面或者胞內(nèi)表達不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對照時，同型對照非特異性的結(jié)合會超過抗體的特異性，所以會造成這種現(xiàn)象，在細胞表面時如圖所示。這個時候推薦使用其他陰性對照，如空白對照等。

三、補償微球
流式細胞儀的熒光補償隔一段時間之后需要調(diào)整到適合的位置。如果熒光補償沒有調(diào)節(jié)好，會導致細胞分群不明顯或者流式檢測得到的結(jié)果圖非常不漂亮，而且會影響到檢測結(jié)果的不真實。熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)對初學者來說非常不容易掌握，同時，補償調(diào)節(jié)是流式細胞術(shù)中比較難掌握的操作。尤其是一些不常見的標志檢測時，需要經(jīng)驗非常豐富的流式操作者根據(jù)多年的經(jīng)驗判斷調(diào)節(jié)補償，才可以得到比較好的數(shù)據(jù)和圖片。那么，現(xiàn)在不需要這么麻煩。因為補償微球讓一切變得更簡單。BD CompBeads是專用于流式細胞儀多色分析的熒光補償調(diào)整微球。它的實用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析時補償難調(diào)、耗費樣本（往往用待測樣本單標來進行補償調(diào)節(jié)）的缺點。它本身不攜帶任何熒光，借助于與客戶自己的特異性熒光抗體孵育結(jié)合來調(diào)節(jié)補償。它不但能象待測的樣本細胞一樣在同樣的實驗條件下固定、破膜等，操作起來很簡單，靈敏度高，一致性好，使補償更輕松更準確，而且最難得的是它最適合于多色分析（如五色、六色、七色等）和復合熒光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因為這時的補償往往難度較大。各型號的流式儀器均能使用。Compbeads使用后可以將流式的條件保存，方便下次做同樣的熒光染色搭配時參考用。