優(yōu)化重組人蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

    如果你想在大腸桿菌中表達(dá)人的基因，你會(huì)怎么做？從cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增？提總RNA，做RT-PCR？克隆、測(cè)序？現(xiàn)在，這些繁復(fù)的步驟都不需要了。你只要拿到一個(gè)QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體，立即就可以開始誘導(dǎo)表達(dá)啦！PCR、亞克隆、測(cè)序，通通拋到腦后吧。

    最新的QIAgenes表達(dá)載體上含有完全測(cè)序的人類基因的cDNA，目前已有35,000個(gè)人類ORF的全長(zhǎng)cDNA構(gòu)建在載體上。為了在E.coli表達(dá)系統(tǒng)中得到最高產(chǎn)量的蛋白，QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體上的蛋白編碼序列從密碼子偏好性、mRNA穩(wěn)定性及二級(jí)結(jié)構(gòu)等多方面來考慮，通過專利的軟件進(jìn)行了優(yōu)化。

QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體的特征：

*    T7啟動(dòng)子，在BL21(DE3)等菌株中高效表達(dá)；或用于基于E.coli的體外表達(dá)系統(tǒng)（如EasyXpress E. coli-based kits）

*    6組氨酸標(biāo)簽在Ni-NTA matrices上一步親和純化

*    卡那霉素抗性用于篩選

圖1 QIAgenes表達(dá)載體的圖譜

為高效表達(dá)優(yōu)化編碼序列

真核蛋白在原核系統(tǒng)上表達(dá)遇到的最大障礙就是細(xì)菌與哺乳動(dòng)物細(xì)胞密碼子的偏好性不同。另外，mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能也會(huì)影響翻譯效率，減少蛋白產(chǎn)量。QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體上的蛋白編碼序列根據(jù)E.coli密碼子偏好性來進(jìn)行優(yōu)化，且消除了序列重復(fù)及其他可能產(chǎn)生mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的元素，使蛋白表達(dá)更加高效。

去除信號(hào)肽

在真核細(xì)胞中，糖基化的蛋白及分泌蛋白是由核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜來合成的。這種類型的蛋白通常在N端有一個(gè)信號(hào)肽，通常包含13-36個(gè)疏水殘基。在E.coli系統(tǒng)表達(dá)時(shí)，這段序列必須被去掉。在QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體中，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的信號(hào)肽已經(jīng)從蛋白編碼序列中去除。

實(shí)驗(yàn)流程

在GeneGlobe數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇你感興趣的基因，訂購(gòu)，然后你就得到了直接用于轉(zhuǎn)化的QIAgenes表達(dá)載體。再也不用做文庫(kù)篩選、PCR擴(kuò)增、亞克隆、克隆篩選、測(cè)序等一系列常規(guī)克隆的步驟。

純化與檢測(cè)表達(dá)蛋白

QIAgenes表達(dá)試劑盒包含Ni-NTA Spin Columns和Penta·His Antibodies，可快速有效地一步純化和檢測(cè)帶His標(biāo)簽的重組蛋白。這個(gè)標(biāo)簽不僅優(yōu)化用于E.coli表達(dá)，更可通過TAGZyme system有效酶切去除。

合成有翻譯后修飾的蛋白

因?yàn)樵�核�?xì)胞缺少產(chǎn)生翻譯后修飾所必需的酶和細(xì)胞器，如果這些修飾必不可少，那么只能在真核（哺乳動(dòng)物或昆蟲）系統(tǒng)中表達(dá)目的蛋白。QIAgenes（2008年下半年上市）將是一個(gè)很好的選擇。它也是序列優(yōu)化的，包含所有元件的即用型質(zhì)粒，能在昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)翻譯后修飾的真核蛋白。

表達(dá)膜蛋白

盡管在E.coli中異質(zhì)表達(dá)人的某些膜蛋白也是可能的，但如果在真核系統(tǒng)中表達(dá)這種蛋白，成功的可能性會(huì)更大一些。因此我們推薦用QIAgenes昆蟲/哺乳動(dòng)物表達(dá)載體（2008年下半年上市）來表達(dá)膜蛋白。

應(yīng)用

QIAgenes大腸桿菌表達(dá)載體能增加表達(dá)成功率，提高人類蛋白的異質(zhì)表達(dá)量，用于功能分析、結(jié)構(gòu)分析和相互作用研究。（生物通編輯余亮）