454公司可謂新一代測序技術的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》雜志以里程碑事件報道，開創了邊合成邊測序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被羅氏診斷公司以1.55億美元收購。在已有GS 20的技術基礎上，羅氏和454公司不斷加大創新投入，又于2007年推出了性能更優的第二代基因組測序系統——Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。今年10月，454推出了全新的GS FLX Titanium系列試劑和軟件，讓GS FLX的通量一下子提高了5倍，準確性、讀長也進一步提升。

GS FLX系統的測序原理

讓我們先來了解一下GS FLX系統的測序原理。它是一種依靠生物發光進行DNA序列分析的新技術：在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，熒光素酶和雙磷酸酶的協同作用下，將引物上每一個dNTP的聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來。通過檢測熒光信號釋放的有無和強度，就可以達到實時測定DNA序列的目的。此技術不需要熒光標記的引物或核酸探針，也不需要進行電泳；具有分析結果快速、準確、高靈敏度和高自動化的特點。

GS FLX在進行測序時，使用了一種叫做“PicoTiterPlate”（PTP）的平板。它含有160多萬個由光纖組成的孔，孔中載有化學發光反應所需的各種酶和底物。

測序開始時，放置在四個單獨的試劑瓶里的四種堿基，依照T、A、C、G的順序依次循環進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在各種酶的作用下，經過一個合成反應和一個化學發光反應，最終將熒光素氧化成氧化熒光素，同時釋放出光信號。此反應釋放出的光信號實時被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列。

新升級讓性能全面提升

新發布的Titanium系列試劑，是對現有GS FLX平臺的重要升級。升級內容包含耗材、試劑和軟件。你無需對儀器的硬件做任何昂貴的升級，只改進試劑和軟件，就能立刻實現性能提升。升級之后，每輪測序能產生100萬個讀長片斷，高質量（Q20）的讀長增加至400 bp。第400個堿基的準確率是99%，之前的更高。通量也提高了5倍，目前每輪運行能獲得4-6億個堿基對，所需時間為10小時。
★ PTP平板的創新重設計  重新設計之后，PTP平板上孔的密度更高，利用更小的DNA捕獲磁珠進行金屬覆蓋，改善了信號質量，因此讀長的數量和長度都明顯改善，同時準確性更高。目前孔的直徑是29 um，DNA捕獲磁珠的大小是20 um。
★ 改進的測序試劑  改進的GS FLX Titanium試劑顯著降低了背景噪音，因此在幾乎相同的運行時間內，讀長更加長。
★ 升級的軟件  優化用于超高通量測序的軟件，能輕松對更大、更復雜的基因組進行拼接和作圖。
★ GS FLX 2.0版  它與以前版本的輸出數據也完全兼容，讓片斷能夠共同拼接和作圖。

GS FLX系統的工作流程

GS FLX系統提供了從樣品制備到后續的生物信息學分析的完整解決方案。概括起來，就是“一個片斷="一個磁珠" fragment = One bead = One read）

1）樣品輸入并片斷化：GS FLX系統支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA，PCR產物，BAC，cDNA，小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300－800 bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴增產物，這一步則不需要。短的PCR產物則可以直接跳到步驟3)。

2）文庫制備：借助一系列標準的分子生物學技術，將A和B接頭（3’和5’端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將在用于后續的純化，擴增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。

3）一個DNA片斷＝一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片斷。磁珠結合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片斷的微反應器。

4）乳液PCR擴增：每個獨特的片斷在自己的微反應器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片斷而言，擴增后產生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片斷仍然結合在磁珠上。

5）一個磁珠＝一條讀長：攜帶DNA的捕獲磁珠隨后放入PTP板中進行后繼的測序。PTP孔的直徑（29um）只能容納一個磁珠（20um）。然后將PTP板放置在GS FLX中，測序開始。每一個與模板鏈互補的核苷酸的添加都會產生化學發光的信號，并被CCD照相機所捕獲。

6）數據分析：GS FLX系統在10小時的運行當中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息。GS FLX 系統提供兩種不同的生物信息學工具對測序數據進行分析，適用于不同的應用：達400 MB的從頭拼接和任何大小基因組的重測序。

GS FLX系統廣闊的應用天地

作為唯一能實現序列讀長超過400 bp的新一代測序技術，GS FLX系統可實現包括全部外顯子和其他基因組區域的單體型分析在內的綜合分析。該系統高度精確、超長序列讀長促使一系列強大應用成為可能，新的樣本制備工具進一步簡化了這些工作。其中包括檢測癌癥樣品中低頻率體細胞突變的超深度測序，HIV感染個體的稀有變異探索，疾病相關區域外顯子序列分析，通過全基因組聯合分析和對16S核糖體RNA區域的鑒定來描繪出宏基因組樣品中的微生物豐度和多樣性。

454測序系統除了為多項研究領域開辟了基因組分析之路，同時也加速了探索的步伐。一般來說，研究、分析、撰寫并提交論文，經同行評議后發表，需要一年左右的時間。而利用Genome Sequencer系統發表論文的速度，顯然表明454測序結果的數據質量高，且分析簡單。超長讀長與易用的分析工具相結合，讓研究人員能更集中精力于科學研究，而不是研究過程中的某個技術細節。這樣研究項目能快速完成，接著踏上新的研究道路。

在新一代測序技術中，GS系統是最多產的。截至2008年9月，已經發表了250多篇高質量的paper。其中Nature 20篇、Science 13篇、Cell 6篇、Genome Research 20篇、PNAS 24篇。光是這些數據就讓人咂舌。這些研究跨越了測序應用的多個方面：82篇全基因組測序論文包括比較基因組學的從頭測序和重測序；54篇小分子RNA研究；37篇聚焦快速興起的宏基因組學；27篇關于轉錄組圖譜分析，包括全轉錄組拼接和表達圖譜；13篇研究染色體結構和表觀遺傳學；10篇有關稀有變異檢測的超深度測序這個新領域；11篇研究古老RNA。其余的文章關注454測序系統的技術和生物信息學。多種多樣的應用彰顯出454測序系統的能力，那些傳統意義上無法用測序來解決的問題現在也一并解決了。

上個月，美國加利福尼亞大學的研究小組利用全新的GS FLX Titanium系列試劑對海洋樣品的宏基因組進行測序，發現了一種全新的藍藻物種，文章發表在11月14日的《Science》雜志上。這項研究是系統升級后發表的首篇文章。首席研究員Jonathan Zehr對于獲得數據及分析結果的速度非常震驚。他表示：“多年來我們一直試圖培養這種微生物，但都沒有成功。有了GS FLX Titanium，我們在幾天之內就通過單次測序運行，從環境樣品直接獲得了寶貴的基因組信息。這個系統超長的讀長對于我們從復雜的微生物群體中鑒定并分析這種獨特的細菌基因組來說非常關鍵。”

北美多個主要的基因組中心立即進行采購也是儀器性能提升的最好佐證。貝勒醫學院成為第一個安裝了10臺GS FLX儀器的機構，圣路易斯的華盛頓大學也立刻增加至8臺。麻省理工大學和哈佛大學Broad研究院目前的儀器數量也是10臺。貝勒醫學院人類基因組測序中心的主管Richard Gibbs教授表示：“我們很榮幸能第一個使用GS FLX Titanium試劑，也非常滿意。新試劑的性能與454承諾的一樣好。新的試劑有效取代了Sanger測序，因此我們正將其應用到我們中心10臺GS FLX儀器上。”

貝勒醫學院人類基因組測序中心的助理教授Stephen Richards博士表示, “利用454生命科學獨特的3K和20K配對末端讀序法，我們的N50 contig長度達到30-50 kb，N50 scaffold的大小也超過3 Mb，基因組的序列覆蓋度為12倍。與對照的果蠅基因組相比，這個結果說明GS FLX Titanium系列讀長至少相當于Sanger讀長的8倍，而速度卻快得多，費用也少了一個數量級。”

麻省理工大學和哈佛大學聯合Broad研究院測序部門的主管Rob Nicol博士表示：“長達400bp的序列讀長和更高的測序讀長密度，新Titanium系列的改進有助于開發更高效、更高通量的工作流程，以應用于大規模測序工作中----例如人類微生物組計劃（HMP）中的微生物全基因組測序。GS FLX Titanium系列的高效步驟讓我們簡化了工作流程，大大縮短了從樣品到數據再到結果的時間。”

你也能實現新一代測序的夢想

當然，不是每個單位都能像貝勒醫學院一樣大手筆，購買10臺GS FLX測序儀。可能光是開機運行的費用都已經讓我們大呼吃不消。不過，你依然有機會實現新一代測序的夢想。最近，羅氏應用科學部攜手國家人類基因組南方研究中心推出“珠聯璧合，傾情回饋“的特價活動。你只需提供21 ug基因組DNA樣品，并標明想要捕獲的區域，他們將負責用NimbleGen的芯片捕獲富集DNA，并用GS FLX進行高通量測序，最終你得到的是測序結果。費用也只是13萬元，比自己測都便宜多了，而且多輕松啊，連引物設計都省了，只要分析分析，就能發很好的paper了。活動只進行到12月31日，想要測序的同學可千萬不要錯過了，說不定下一個發頂級雜志的就是你哦。

（生物通 余亮）